1例急性白血病患者多次血小板輸注無效原因分析與解決思路

屈愛春，郭 平△

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，山西太原 030001；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025

血小板作為正常人外周血中最小的有形成分，在血栓和止血、傷口修復(fù)、炎癥和癌癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要的生理功能[1]。造成血小板計數(shù)減少的主要原因包括血液系統(tǒng)疾病引起的病理性減少[2]及體外因素導(dǎo)致的假性減少[3]。臨床上對血小板計數(shù)過低的血液病患者多采取血小板輸注的方法，以降低出血風(fēng)險[4]。血液病合并多抗凝劑依賴的血小板假性減少十分罕見，若未及時發(fā)現(xiàn)并糾正血小板計數(shù)易引發(fā)臨床過度醫(yī)療。本文通過分析1例急性白血病患者血小板反復(fù)輸注無效的原因，探尋多抗凝劑依賴情況下血小板聚集的應(yīng)對策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，男，68歲，因反復(fù)發(fā)熱半月，發(fā)現(xiàn)全血細胞減少10 d前往當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診。查體：重度貧血貌，言語含糊，雙下肢輕度水腫，右側(cè)肢體肌力4級，余未見明顯異常。完善相關(guān)檢查，結(jié)合骨髓細胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及細胞遺傳學(xué)檢查提示急性髓系白血病伴BCR-ABL基因陽性。預(yù)備接受化療前患者血常規(guī)結(jié)果提示貧血、血小板計數(shù)減少，臨床遂予以血小板輸注，但效果不佳，血小板計數(shù)始終維持在20×109/L左右。治療期間患者并無出血表現(xiàn)，為明確血小板輸注無效原因至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院就診。

1.2儀器和試劑 BC-6800 PLUS全自動血細胞分析儀及配套試劑購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；XN-90000全自動血細胞分析儀、SP-10推染片機及配套試劑購自日本希森美康株式會社。0.1 g/mL阿米卡星注射液購自上海信誼金朱藥業(yè)有限公司；乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝真空采血管、枸櫞酸鈉抗凝真空采血管、肝素抗凝真空采血管購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及制片 采集患者EDTA-K2、枸櫞酸鈉和肝素抗凝血標(biāo)本，分別于采集后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h使用推染片機制作外周血涂片，鏡檢觀察血涂片中血小板形態(tài)及分布情況。

1.3.2血小板估算方法 肝素抗凝標(biāo)本采集后立即涂片，計數(shù)體尾交界處20個油鏡視野下紅細胞和血小板的數(shù)量。血小板估算結(jié)果=(鏡下血小板計數(shù)/鏡下紅細胞計數(shù))×血細胞分析儀紅細胞計數(shù)。重復(fù)3次取平均值。

1.3.3血小板計數(shù) BC-6800 PLUS全自動血細胞分析儀使用光學(xué)法(PLT-O通道)進行血小板計數(shù)；XN-90000全自動血細胞分析儀使用電阻抗法(PLT-I通道)進行血小板計數(shù)；采用核酸熒光染色法(PLT-F通道)進行血小板計數(shù)。

1.3.4阿米卡星血小板解聚試驗 在EDTA-K2抗凝血中加入一定量阿米卡星注射液，使終濃度達到6.5 mg/mL。分兩種方法加入。方法一：采血后立即加入，在即刻、30 min、1 h、2 h、使用儀器PLT-I通道及PLT-F通道分別計數(shù)血小板；方法二：在采血后即刻、30 min、1 h、2 h分別加入阿米卡星，混勻后靜置10 min，使用儀器PLT-I通道及PLT-F通道分別計數(shù)血小板。

不同抗凝標(biāo)本在不同儀器檢測通道中的血小板計數(shù)結(jié)果：在不加阿米卡星的前提下，使用儀器PLT-I通道、PLT-O通道及PLT-F通道對EDTA-K2、枸櫞酸鈉和肝素抗凝血標(biāo)本的血小板進行計數(shù)，檢測時間點設(shè)為采集后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同抗凝標(biāo)本各時間點外周血涂片鏡檢結(jié)果 EDTA-K2與枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本采集后即刻涂片，鏡下可見大量血小板聚集；肝素抗凝標(biāo)本采集后即刻涂片，鏡下見血小板散在分布，少量聚集。30 min后3種抗凝劑在各時間點均可觀察到血小板成片聚集。證實患者存在多抗凝劑依賴的血小板假性減少。見圖1。

注：A為EDTA-K2抗凝血即刻涂片鏡檢；B為枸櫞酸鈉抗凝血即刻涂片鏡檢；C為肝素抗凝血即刻涂片鏡檢。

2.2血小板估算結(jié)果 肝素抗凝血采集后即刻涂片，計數(shù)體尾交界處20個油鏡視野下紅細胞和血小板的數(shù)量分別為1 840個和386個，儀器紅細胞計數(shù)結(jié)果為1.64×1012/L。根據(jù)上述公式可得血小板估算結(jié)果為344×109/L。重復(fù)3次取平均值，該患者血小板估算結(jié)果為340×109/L，略高于正常參考區(qū)間。

2.3阿米卡星血小板解聚試驗 在采血后立即加入阿米卡星，并在不同時間點使用儀器PLT-I通道及PLT-F通道進行檢測，結(jié)果顯示血小板計數(shù)無明顯變化。在采血后不同時間點加入阿米卡星，并使用儀器PLT-I通道及PLT-F通道進行檢測，結(jié)果顯示血小板計數(shù)輕微升高，但低于參考區(qū)間。見表1、2。

2.4不同抗凝標(biāo)本儀器PLT-I通道、PLT-F通道、PLT-O通道血小板計數(shù)結(jié)果 使用儀器PLT-I通道進行檢測，EDTA-K2和枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本在各時間點的血小板計數(shù)結(jié)果均明顯低于參考區(qū)間；肝素抗凝標(biāo)本在即刻檢測時血小板計數(shù)處于參考區(qū)間內(nèi)，隨后逐漸下降，4 h后穩(wěn)定在參考區(qū)間下限附近。使用儀器PLT-F通道進行檢測，各抗凝標(biāo)本的血小板計數(shù)結(jié)果均高于同一時間點PLT-I通道檢測結(jié)果，并隨時間延長逐漸下降。使用儀器PLT-O通道進行檢測，EDTA-K2抗凝標(biāo)本的血小板計數(shù)結(jié)果在4 h內(nèi)均高于參考區(qū)間；枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本的血小板計數(shù)結(jié)果隨時間延長緩慢降至參考區(qū)間下限；肝素抗凝標(biāo)本血小板計數(shù)在即刻、30 min高于參考區(qū)間，1 h后降至參考區(qū)間內(nèi)。PLT-O通道EDTA-K2抗凝標(biāo)本各時間點檢測結(jié)果與鏡下估算結(jié)果較符合。且3種抗凝標(biāo)本的PLT-O通道血小板計數(shù)結(jié)果與PLT-I通道、PLT-F通道相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PLT-O通道的血小板計數(shù)結(jié)果高于相同抗凝條件下另外兩通道的計數(shù)結(jié)果。同時結(jié)果顯示以健康人EDTA-K2、枸櫞酸鈉及肝素抗凝血作為對照，其血小板計數(shù)結(jié)果在不同血小板檢測通道下的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。

表2 不同抗凝標(biāo)本儀器PLT-I通道、PLT-F通道、PLT-O 通道血小板計數(shù)結(jié)果(×109/L)

表3 健康對照不同抗凝標(biāo)本儀器PLT-I通道、PLT-F 通道、PLT-O通道血小板計數(shù)結(jié)果(×109/L)

3 討 論

本研究患者因急性髓系白血病于外院就診時血常規(guī)提示貧血伴血小板嚴重減少但接受血小板輸注無效前來就診。為明確血小板減少原因，順利采集患者EDTA-K2、枸櫞酸鈉及肝素抗凝血后在不同時間點推片鏡檢。結(jié)果顯示在EDTA-K2、枸櫞酸鈉及肝素3種抗凝劑的外周血涂片中均觀察到了血小板聚集現(xiàn)象。肝素抗凝標(biāo)本在即刻推片時鏡下血小板以散在分布為主，根據(jù)3次血小板估算結(jié)果知目前患者血小板計數(shù)高于參考區(qū)間，可能與近期多次血小板輸注有關(guān)。因此該患者血小板反復(fù)輸注無效的原因為多抗凝劑依賴的血小板假性減少。

臨床上急性白血病患者因骨髓惡性細胞克隆性增殖導(dǎo)致正常造血受抑，引起外周血紅細胞、血小板計數(shù)降低的情況十分常見。當(dāng)這類患者血小板計數(shù)過低時，往往通過接受血小板輸注降低出血風(fēng)險。但當(dāng)血小板反復(fù)輸注無效時，務(wù)必注意是否存在抗凝劑依賴的血小板假性減少這一特殊現(xiàn)象。該現(xiàn)象主要發(fā)生于EDTA-K2抗凝標(biāo)本，偶見于枸櫞酸鈉、肝素抗凝標(biāo)本[5]，多抗凝劑依賴的血小板假性減少更是罕見[6]。在惡性腫瘤(包括血液系統(tǒng)腫瘤)患者中該現(xiàn)象的出現(xiàn)概率高于其他患者，但其機制還有待探索[7]。目前公認的假說是EDTA-K2抗凝血中鈣離子水平的降低、血小板膜表面電荷數(shù)量的改變及標(biāo)本離體后溫度的下降可能影響了血小板GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物的構(gòu)象，導(dǎo)致隱蔽抗原的暴露[8]。當(dāng)血液中存在與之對應(yīng)的自身抗體時引起血小板的體外聚集[9]。但枸櫞酸鈉及肝素依賴的血小板假性減少的原因目前尚不明確。

對于EDTA-K2依賴的血小板假性減少，目前的解決方案是改用枸櫞酸鈉或肝素抗凝血重新檢測[10]。但對于多抗凝劑導(dǎo)致的血小板聚集，需要尋找替代方案。研究顯示氨基糖苷類抗菌藥物阿米卡星可以在一定程度上解決該問題[9]。但就本研究患者而言，采取同一時間點添加阿米卡星后作用不同時間或不同時間點添加阿米卡星后反應(yīng)相同時間的策略都無法有效糾正血小板計數(shù)結(jié)果。SAKURAI等[11]在首次報道氨基糖苷類抗菌藥物可阻止血小板假性減低中時注意到其研究對象入院前的血小板計數(shù)結(jié)果均正常，而血小板假性減低的現(xiàn)象在住院使用抗菌藥物后的4～10 d發(fā)生。因此推測機體可能產(chǎn)生了針對這類抗菌藥物的自身抗體并與血小板表面抗原存在交叉反應(yīng)，故而引起血小板聚集。而氨基糖苷類抗菌藥物的添加恰好起到中和作用。所以臨床工作中使用阿米卡星并非總是有效的原因可能與患者體內(nèi)是否存在針對氨基糖苷類抗菌藥物的自身抗體有關(guān)，即抗體存在時有效，抗體缺失可能無效。筆者回顧了該患者入院期間的用藥情況，并未發(fā)現(xiàn)使用氨基糖苷類抗菌藥物的記錄。

傳統(tǒng)的血細胞分析儀計數(shù)血小板的原理基于電阻抗法，即根據(jù)顆粒經(jīng)過計數(shù)小孔時產(chǎn)生的脈沖信號數(shù)量進行計算并依據(jù)電信號的大小區(qū)分紅細胞與血小板，在多數(shù)情況下使用該方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠[12]。但當(dāng)標(biāo)本中出現(xiàn)巨大血小板、破碎紅細胞、小紅細胞及冷球蛋白等干擾因素時，阻抗法血小板計數(shù)結(jié)果往往存在偏差，此時基于核酸熒光染色原理的PLT-F通道更適用于上述情況[13]。但當(dāng)面對多抗凝劑依賴的血小板假性減少，PLT-I通道與PLT-F通道受檢測原理所限無法糾正血小板計數(shù)。本研究結(jié)果顯示3種檢測模式中只有PLT-O通道可以糾正EDTA-K2抗凝標(biāo)本血小板假性減少的計數(shù)結(jié)果，且糾正結(jié)果與鏡下估算結(jié)果相近，受時間因素影響較小。PLT-O通道解聚血小板的原理是基于加熱、抑制血小板活化及高速攪拌等理化手段對血小板聚集結(jié)構(gòu)的弱化作用。血小板解聚后通過熒光染色，激光檢測三維分析，達到糾正血小板計數(shù)的效果。目前對EDTA-K2依賴的血小板假性減低已顯示出較好的解聚效果[14]，但血液病合并的多抗凝劑依賴的血小板假性減少現(xiàn)僅這1例報道，對該病例的研究顯示該方法可以取得較好的解聚效果，今后在獲得更多病例數(shù)后將進一步驗證該結(jié)果。

臨床工作中對于血小板低于參考區(qū)間且出現(xiàn)血小板直方圖分布異常的情況，應(yīng)在排除采血原因后及時推片鏡檢。如鏡下觀察到血小板聚集應(yīng)考慮抗凝劑依賴的血小板假性減少的可能。對出現(xiàn)血小板聚集的標(biāo)本尤其是多抗凝劑依賴的血小板假性減少，如果常規(guī)手段無法解決，采用邁瑞的PLT-O通道進行檢測或能得到更接近患者真實情況的結(jié)果，在節(jié)約醫(yī)療資源的同時避免了重新采血帶來的困擾，適合在實際工作中開展。