2015-2017年新生兒原發性肉堿吸收障礙串聯質譜法回顧性分析*

程昱璇，張春燕，舒 楊，蔣 濤，崔佳奕，檀旭東，桑培培，史文杰，張民杰，田亞平

中國人民解放軍總醫院醫學創新研究部出生缺陷防控技術研究中心，北京100853

原發性肉堿吸收障礙(CUD)又稱原發性肉堿缺乏癥或肉堿轉運障礙，是常染色體隱性遺傳的脂肪酸β氧化代謝病，是一種與細胞線粒體有關的疾病[1]。CUD是由于SLC22A5基因(位于染色體5q31.1上，約30 kb)突變導致細胞膜有機陽離子轉運體2(OCTN2)缺陷，造成多個組織受累包括骨骼肌、心肌、腦和腎臟等組織內肉堿水平不足以支持長鏈脂肪酸進入線粒體參與氧化[2]。CUD發生率約為0.8/10萬～2.5/10萬，不同地區發生率存在差異，其為脂肪酸氧化代謝的常見疾病[3]。

本研究采用血液串聯質譜(MSMS)篩查的方法，對10.9萬份各地標本進行初篩，現對這部分標本的肉堿檢測結果作回顧性分析報道。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015-2017年于本院出生缺陷防控技術研究中心進行新生兒MSMS篩查的10.9萬份濾紙干血片標本，在新生兒父母簽署知情同意書的前提下，用 MSMS進行多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的檢測分析，標本來源于四川、新疆、西藏、貴州、湖北、北京出生的新生兒。

1.2儀器與試劑 使用美國Waters Xevo TQD質譜儀、美國Waters 2777自動進樣系統、1525u高效液相儀、孵浴震蕩儀、美國 PerkinElmer 流動相和萃取溶劑試劑盒(含甲醇、水和草酸)、美國 PerkinElmer非衍生化串聯質譜試劑盒、琥珀酰丙酮內標液進行前處理并上機檢測。

1.3方法

1.3.1MSMS試驗分析 用包含穩定同位素標記的氨基酸、?；鈮A和琥珀酰丙酮的內標準品的溶劑萃取濾紙干血片中的氨基酸、游離肉堿(C0)和?；鈮A，然后用MSMS系統分析。具體操作步驟如下：用1 mL萃取液溶解內標干粉制成儲備工作液，于2～8 ℃保存待用。用直徑3 mm打孔鉗打取濾紙片至96孔板中，按照萃取液與內標液110∶1的比例配制萃取工作液，每孔加入含氨基酸和?；鈮A同位素內標工作液100 μL，45 ℃，700 r/min密封孵育震蕩45 min，提取80 μL萃取液轉移至V型底的96孔板內，鋁膜覆蓋，放置在自動進樣器上靜置2 h后即可檢測[4]。采用美國Waters公司Masslynx軟件處理數據，由已知水平的內標自動計算出所測樣品的氨基酸、?；鈮A和琥珀酸丙酮的水平。同一標本異常指標2次結果均超過參考值，判為篩查陽性者立即召回。對C0偏低的患兒母親同時進行血液?；鈮A水平分析。

1.3.2SLC22A5基因測序分析 篩查出新生兒陽性標本(C0水平低于9.5 μmol/L)，采用干血片法提取基因組DNA，進行全外顯子測序(WES)，測序結果與人類基因組SLC22A5基因序列進行比較[5]。

2 結 果

在10.9萬份篩查標本中初次篩查提示CUD(或繼發性肉堿吸收障礙)124例，其中男54例、女70例，平均年齡(164.40±16.18)d，平均體質量(3 346.00±54.49)g，平均C0為(6.27±0.16)μmol/L，本實驗室C0的參考范圍為9.5～48.0 μmol/L。共召回39例患兒標本再次進行二次篩查，最終對確定6例疑似患兒進行基因確診，其中3例提示基因突變，對應C0及?；鈮A譜水平見表1。3例患兒SLC22A5基因診斷到2種突變，2例c.1400C>G(p.S467C)雜合突變和1例c.51C>G(p.F17L)純合突變，見表2。病例1患兒因丙二?；鈮A水平升高召回，基因檢測發現另有SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，C0水平為12.37 μmol/L。病例2患兒C0水平為4.14 μmol/L，召回基因檢測發現SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低。病例3患兒C0水平為3.57 μmol/L，召回基因檢測發現SLC22A5基因c.51C>G(p.F17L)純合突變，肉堿及酰基肉堿譜整體降低明顯。

表1 3例CUD患兒C0及?；鈮A譜水平(μmol/L)

表2 3例CUD患兒基因檢測結果

3 討 論

研究表明在法羅群島CUD的患病率最高為1∶300[6]，日本的患病率約為1∶40 000[7]，澳大利亞為1∶37 000～1：100 000[8]，美國為1∶142 000[9]，在中國河南省的患病率為1∶31 499[10]，浙江省為1∶23 862[11]，上海市為1∶45000[1]，河北省為1∶17 785[12]，本研究共篩查來自四川、新疆、西藏、貴州、湖北、北京6地新生兒標本10.9萬例，通過MSMS篩查出124例疑似陽性標本，陽性疑似率約為1.14‰，確診CUD 3例，患病率約為1∶36 333，與報道的中國CUD新生兒篩查患病率相符[12]。MSMS技術對早期發現CUD有提示意義，但最終確診需結合其他檢測手段，如尿有機酸檢測和基因檢測等，并結合臨床明確診斷。

CUD是由SLC22A5基因編碼的OCTN2肉堿轉運蛋白突變引起的常染色體隱性(AR)遺傳疾病，有10個外顯子[13]。SLC22A5突變數據庫(http://www.arup.utah.edu/database/OCTN2/OCTN2_display.php)中描述了150多種遺傳變異，其中86種具有致病性(包括錯義、無義、插入缺失、移碼，剪接位點改變突變和一個大基因缺失)[13]。大多數研究認為c.760C> T(p.R254X)和c.1400C>G(p.S467C)是中國人最常報道的突變[14]。本研究結果檢測出2例c.1400C> G(p.S467C)和1例c.51C>G(p.F17L)，c.1400C>G(p.S467C)占比2/3，與報道相一致[15]?；蛲蛔冎缕渚幋a的肉堿轉運蛋白無法錨定細胞膜而滯留于細胞質中，或結構及功能域不同程度受損，導致該蛋白的轉運功能缺陷。肉堿(β-羥基-γ-三甲基丁酸銨)是一種衍生自氨基酸的必不可少的水溶性分子[15]。在非素食主義者中，肉堿的主要來源是紅肉，家禽和奶制品[16]，幾乎占人體總貯存量的3/4[17]。肉堿由腸道內轉入到血液及由血液內轉入到細胞的量減少，血液及細胞內肉堿缺乏，尿流失增加，脂肪酸β氧化代謝受阻[18]。CUD可于任何年齡發病，患者表現為心肌疾病、心功能降低、肌無力、肌張力減退及肝功能異常等[19]，若是不及時醫治，可導致死亡。有些患兒在診斷時通常是完全無癥狀的，可通過測量血漿肉堿水平(游離和總量)和研究肉堿在成纖維細胞中的轉運來確認[15]。左卡尼汀的治療，使越來越多CUD患兒的預后得到了改善[20-21]。CUD是為數不多的治療效果良好的遺傳病之一，所以早期診斷、及時治療是改善患兒預后的關鍵。

本研究通過足跟采血，滴于專用濾紙片后晾干，寄送到本實驗室使用MSMS方法測定C0及其他?；鈮A，CUD患兒C0及多種酰基肉堿水平降低，C0水平正常參考值為9.5～48.0 μmol/L。病例1患兒因丙二?；鈮A水平升高召回，基因檢測發現另有SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，C0串聯檢測結果正常。病例2患兒C0水平為4.14 μmol/L，召回基因檢測發現SLC22A5基因c.1400C>G(p.S467C)雜合突變，肉堿及?；鈮A譜整體降低。病例3患兒C0水平為3.57 μmol/L召回基因檢測發現SLC22A5基因c.51C>G(p.F17L)純合突變，肉堿及酰基肉堿譜整體降低明顯。雜合突變個體的肉堿轉運活性為正常個體的50%，C0值可處于臨界低水平[22]。此外，C0能通過胎盤從母體轉運給胎兒，若母親體內肉堿充足，CUD胎兒可以從母體獲得肉堿供給，在生后的一段時間內仍保持較充足的肉堿儲備，導致篩查時出現假陰性。若母親為原發性肉堿缺乏癥或各種原因導致血液中肉堿不足，也會導致新生兒篩查時C0水平低于正常[23]，導致假陽性，故新生兒篩查陽性者，需要同時測母親C0水平，以便除外因母體原因導致的繼發性肉堿缺乏。

CUD是一種潛在的致死性疾病，早期診斷和治療是決定預后的關鍵。本研究使用MSMS技術篩查10.9萬份標本，檢測出124例CUD疑似陽性患兒，對可疑陽性患者的標本進行SLC22A5基因測序，進一步確診了3例CUD患兒。MSMSM技術的應用使CUD的早期診斷成為可能，結合測序技術也為CUD 的遺傳咨詢和產前診斷提供了重要信息。