乙型肝炎病毒反轉錄酶區恩替卡韋耐藥位點突變分析*

張宏宇，申紅玉，鄭國軍

江蘇省常州市第三人民醫院檢驗科，江蘇常州 213001

近年來，恩替卡韋(ETV)作為一種強效、耐藥基因屏障高的藥物，廣泛應用于慢性乙型肝炎(CHB)患者的抗病毒治療中[1]，ETV在病毒學、組織學和生物化學改善方面的效果優于拉米夫定(LAM)和阿德福韋酯(ADV)?！堵砸倚透窝追乐沃改?2019年版)》[2]按照“強效低耐藥”的原則推薦將ETV、富馬酸替諾福韋酯(TDF)和丙酚替諾福韋(TAF)作為CHB防治一線藥物，非一線藥物比如LAM、替比夫定(LdT)和ADV不再推薦使用。同時，指南進一步建議如果原來使用的藥物是LAM和LdT，即使病毒控制得很好也建議調整治療，原來應用這些藥物沒有出現耐藥的患者建議換用低耐藥藥物治療[2]。

但患者長期使用核苷(酸)類似物(NAs)進行抗病毒治療會使乙型肝炎病毒(HBV)逆轉錄酶區一個或多個位點發生突變，即可導致機體對藥物的敏感性下降甚至產生耐藥[3-4]，致使抗病毒治療失敗。目前，關于ETV耐藥的報道相對較少，在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發生率為1.2%[5]，但在治療過程中，特別是ETV治療其他NAs耐藥的患者易出現病毒學突破等再耐藥現象[6]。有研究回顧性分析了2009—2016年7年間該院收治的12 515例進行HBV耐藥性檢測的患者，結果顯示2016年該院ETV的耐藥突變發生率在17.1%[7]，隨著經濟發展和社會進步，藥物可及性已經得到了很大的改善，部分患者特別是ETV用于治療LAM或ADV耐藥的患者更易發生ETV耐藥的現象[8]。分別ETV耐藥比例不斷升高，成為不容忽視的問題，對于這類患者有必要分析了解其耐藥突變特征，為臨床規范抗病毒治療提供參考。

本研究回顧性分析本院HBV P基因測序ETV耐藥位點陽性患者資料，以期了解本地區HBV耐藥突變特征，為后期臨床規范抗病毒治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年7月至2020年12月在本院就診并進行HBV P區耐藥測序的慢性HBV感染患者7 886例為研究對象，所有患者均接受NAs單藥或序貫治療，經HBV-DNA定量檢測>500 copy/mL，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎和HIV合并感染者1 878例，剩余6 008例，所有診斷均符《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[2]相關標準。

1.2方法

1.2.1P區耐藥測序 采用QIAamp DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取血清中HBV-DNA，美國伯樂公司試劑擴增DNA，反應條件為95 ℃ 5 min后，95 ℃ 10 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共40個循環，取擴增標本產物2～4 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物，目的條帶大小約為500 bp，參考Marker條帶，如目的條帶亮度大于Marker最弱的條帶，則認為擴增成功，可進行下一步純化測序工作。如無肉眼可見目的條帶或目的條帶亮度低于Marker最弱的條帶，則需進行巢式PCR擴增。巢式PCR第一輪擴增引物序列如下，F：5′-ACTGTATTCCCATCCCATCAT-3′；R：5′-TTCGTTGACATACTTTCCAATCA-3′)。第二輪擴增引物序列如下，F：5′-CTTGACATACTTTCCAATCAA-3′；R：5′-AAGGTATGTTGCCCGTTTGT-3′。PCR產物純化擴增產物后，采用ABI3100測序儀對其測序。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.2ETV 耐藥性變異的判斷 本研究ETV耐藥位點變異判斷標準為在LAM耐藥的基礎上(M204I/V和L180M變異)，再加上至少1個ETV耐藥位點[T184、S202 和(或)M250]的變異[9]。

1.2.3臨床實驗室檢測 HBV-DNA檢測采用中山大學達安基因股份有限公司的DNA提取試劑盒，在RocheLightCycler480儀器進行PCR擴增檢測，HBV-DNA結果以<500 copy/mL為陰性；乙型肝炎e抗原(HBeAg)檢測采用鄭州安圖生物公司磁微?；瘜W發光法試劑，在全自動化學發光測定儀AutoLumo A2000上進行檢測；血清肝臟酶學指標丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)的檢測采用邁克公司試劑在日立7600生化儀器上進行檢測，所有操作嚴格按照儀器與試劑說明書進行。

2 結 果

2.1ETV耐藥位點陽性患者的一般資料 篩選出ETV耐藥位點陽性的患者228例，占比3.8%(228/6 008)，男185例，女43例，平均年齡(51.25±11.25)歲，ALT水平為(97.2±146.1)U/L，AST水平為(64.3±93.9)U/L，HBeAg陽性率為47.37%(108/228)，HBV-DNA載量為(6.63±0.12)copy/mL。ETV耐藥位點陽性率從2010年的0.67%逐年上升，到2016年達到峰值6.81%，2017-2019年有一定下降的趨勢，2020年陽性率又上升至5.96%，但送檢病例也有一定數量的減少。見表1。

表1 2010—2020年HBV P區耐藥測序情況及ETV耐藥位點陽性分布情況

2.2臨床主要NAs的使用情況 考慮ETV耐藥率可能與藥物使用情況有關，本研究分析了LAM、LdT、ADV、TDF這4類主要NAs的使用情況(因LAM和LdT屬于同一類藥物，故歸為一組；因系統升級，未能查閱到2010年藥物的使用情況，但不影響整體趨勢)。2011—2014年低耐藥屏障的LAM、LdT和ADV為主要使用的抗病毒藥物，2014—2016年維持一定使用量，2016年后使用量明顯下降；高耐藥屏障藥物ETV在2014年后使用量明顯增加，2017開始高耐藥屏障藥物ETV和TDF使用量全面超過低耐藥屏障藥物；2014年以來，ETV一直是用量最多的藥物。見圖1。

圖1 2011—2020年臨床主要NAs的使用情況

2.3ETV基因型突變模式分析 rtL180M+M204V+S202G和rtL180M+M204V+T184A(G/I/S/L)突變最為常見，分別占42.54%和28.51%；ETV突變模式主要表現為rtL180M+M204V伴隨rtS202G或rtT184A(G/I/S/L)突變，M204I突變相對較少，其中rtL180M+M204I/V合并S202G突變者110例，rtL180M+M204I/V合并rtT184A(G/I/S/L)突變者81例。見表2。

表2 ETV基因型耐藥模式分析

2.4ETV主要耐藥基因突變模式與臨床特征的關系 鑒于ETV主要突變模式為rtL180M+M204I/V合并rtS202G或rtT184A(G/I/S/L)，本研究對這兩種耐藥突變模式患者的一些常見實驗室特征如HBeAg陽性率，HBV-DNA，ALT，AST等進行了比較，結果發現rtL180M+M204I/V合并rtT184A(G/I/S/L)突變模式患者HBeAg陽性率，HBV-DNA，ALT，AST等平均值略高于rtL180M+M204I/V合并rtS202G突變患者，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 ETV主要耐藥突變模式臨床實驗室特征對比分析

3 討 論

采用ETV治療可強效抑制病毒復制，改善肝臟炎癥，安全性較好，長期治療可改善CHB肝硬化患者的組織學病變，降低肝硬化并發癥和肝細胞癌發生率，降低肝臟相關和全因病死率。有研究表明，長期口服ETV或TDF的CHB患者，8年生存率為94.1%[10]。因此抗病毒治療對CHB患者改善生活質量，延長生存時間至關重要。

目前，長期應用NAs進行抗病毒治療的CHB患者體內病毒在這種藥物壓力篩選中更易發生突變而導致治療失敗[9]。有研究報道，在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發生率為1.2%，在LAM耐藥的CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發生率提升至51.0%[5]。多項研究顯示，接受長期ETV或其他NAs治療的CHB患者轉換至TAF治療后，病毒學抑制及腎功能得到顯著改善[11-12]。充分了解本地區HBV耐藥突變模式及相關臨床癥狀對于調整用藥及新耐藥位點預測非常重要。

本研究回顧性分析了近11年來本院進行HBV P區耐藥測序的6 008例患者，篩選出ETV耐藥位點陽性患者共228例，占比3.8%(228/6 008)，與之前報道的在初治CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發生率為1.2%，在LAM耐藥的CHB患者中，ETV治療5年的累積耐藥發生率提升至51.0%[5]存在差異，出現這種情況的原因考慮與本研究入組人群有關，雖然本研究多數為經治患者，但用藥史不祥，有很多是LAM或LdT經治患者，可能會引發ETV累積耐藥，也有很多為ADV經治患者，稀釋了本底系數，且故本研究ETV耐藥位點陽性率在1.2%～51.0%。分析從2010—2020年每年的ETV耐藥位點陽性率，從2010年的0.67%逐年上升，到2016年達到峰值6.81%，與我國學者回顧性分析結果顯示ETV的耐藥突變發生率在2016年上升至17.1%的趨勢基本一致[7]，考慮與本研究時間跨度較長，多數患者為LAM或LdT經治累積耐藥篩選有關；而2017-2019年又有逐漸下降的趨勢，可能與后期ETV、TDF等高耐藥基因屏障藥物大量使用有關，分析這些年的藥物使用情況，2017年開始，高耐藥屏障藥物ETV，TDF的使用量全面超過低耐藥屏障藥物。但在2020年，耐藥率卻又進一步升高至5.96%，出現這種情況可能是高耐藥屏障藥物的使用導致耐藥人數減少，送檢病例減少所致，也可能與長期大量高耐藥屏障藥物使用導致新耐藥的產生有關，需進一步研究探索。

分析ETV耐藥突變模式，結果顯示rtT184A(G/I/S/L)和rtS202G是ETV耐藥相關的最常見變異位點，而rtM250V位點變異較為少見，與之前相關報道一致[13-14]；ETV耐藥基因屏障的打破有賴于rtL180M+M204V/I的存在，本研究顯示大部分ETV耐藥發生在rtM204V的基礎上，rtM204I相對較少，與相關研究基本一致[9]，這可能是因為rtM204I突變株仍保留了對ETV較高的敏感性[13]；由于ETV耐藥突變經常發生在LAM或LdT經治基礎上，rtM204I是LAM和LdT的主要變異形式，因此，有學者推測，在ETV耐藥突變篩選過程中可能存在rtL180M+M204I 突變向rtL180M+M204V突變轉換的過程[14]。有研究表明發生rtT184A/G/I/S基因突變患者的肝臟炎癥狀況比發生rtS202G/I突變的患者更為嚴重，且更易進展為肝硬化[15]，本研究結果則顯示兩種突變模式的疾病嚴重程度無明顯差異，與之前研究不同的原因可能與納入患者臨床分期不明確所致，仍需進一步觀察研究。

本研究對本院近11年CHB患者的ETV耐藥位點陽性進行回顧性分析，若有患者的用藥史會更加完整，但由于時間跨度較長，且大部分患者為門診病例，用藥史、依從性不一，資料追蹤難度較大，無用藥情況說明，預存耐藥情況不明。但作為中國東部地區長期的ETV耐藥位點陽性患者的回顧性分析，本研究對于了解HBV變異情況、預后判斷及換藥治療具有一定的指導意義。