基于生物信息學(xué)方法篩選肝細(xì)胞癌核心生物標(biāo)志物及預(yù)后關(guān)聯(lián)性分析*

劉嬌陽(yáng)，鄧成敏，劉 鐵，李永文，羅 娟，吳凱峰,△

遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/貴州省遵義市第一人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.中心實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義 563000

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于其疾病進(jìn)展快，惡性程度高，預(yù)后差，一直受到人們的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道，全球每年有超過(guò)84萬(wàn)的肝癌確診病例，主要發(fā)生在東亞和非洲部分地區(qū)[1-2]。事實(shí)上，腫瘤的發(fā)生發(fā)展和異常的基因表達(dá)密切相關(guān)。因此，近年來(lái)從分子層面研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展是當(dāng)前的熱點(diǎn)。利用數(shù)據(jù)庫(kù)中的大量數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)與腫瘤的關(guān)系，對(duì)推進(jìn)腫瘤的診療和揭示發(fā)病機(jī)制有著重要的意義，能極大地促進(jìn)腫瘤相關(guān)研究的進(jìn)展。

本研究擬從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出基因數(shù)據(jù)集，從而獲得差異表達(dá)基因(DEGs)，并對(duì)這些DEGs進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。通過(guò)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的可視化，構(gòu)建出關(guān)鍵模塊，得到核心基因，并對(duì)核心基因進(jìn)行生存分析，探索其與HCC分級(jí)、衛(wèi)星病灶和血管浸潤(rùn)的相關(guān)性，旨在為其影響肝癌的發(fā)生和預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 從NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到3個(gè)基因表達(dá)芯片集GSE101685、GSE84402和GSE46408，共包含44個(gè)肝癌組織和28個(gè)癌旁組織標(biāo)本。

1.2DEGs的篩選 本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中自帶的數(shù)據(jù)分析插件GEO2R篩選HCC組織和癌旁組織的DEGs。對(duì)初步得到的DEGs進(jìn)行篩選獲得候選差異基因，條件為表達(dá)差異倍數(shù)值的絕對(duì)值|log Fc(fold change)|≥1.5且校正P值<0.05。利用在線分析工具Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)制作Venn圖，獲得3個(gè)基因數(shù)據(jù)集共有的DEGs。

1.3功能富集分析 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)篩選到的DEGs進(jìn)行功能富集分析，包括GO注釋和KEGG通路分析。篩選條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。

1.4PPI分析 首先，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.4的交互作用可納入本分析。然后用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，MCODE工具用于構(gòu)建PPI中的關(guān)鍵模塊，構(gòu)建參數(shù)為degree cut-off=2,node score cut-off=0.2,k-core=2。利用Cytoscape的BiNgo插件對(duì)關(guān)鍵模塊中DEGs的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行了分析。

1.5關(guān)鍵基因的分析 根據(jù)各關(guān)鍵模塊之間的差異程度，利用MCODE工具在眾多DEGs中篩選中hub基因，即核心基因。用TCGA的cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cbioportal.org)分析核心基因與HCC患者生存的關(guān)系。利用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析核心基因表達(dá)與HCC發(fā)展的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1DEGs的鑒定 3個(gè)數(shù)據(jù)集共包含2 850個(gè)基因(GSE101685基因830個(gè)，GSE84402基因857個(gè)，GSE46408基因1 163個(gè))。取其交集后，有261個(gè)共有DEGs，其中包括124個(gè)上調(diào)基因和137個(gè)下調(diào)基因。見(jiàn)圖1。

圖1 3個(gè)基因數(shù)據(jù)集的Venn圖

2.2GO富集分析和KEGG通路分析 利用DAVID對(duì)DEGs進(jìn)行了生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能的基因功能注釋。將這些結(jié)果按照FDR值<0.05進(jìn)行了篩選，并顯示了每組的3個(gè)主要過(guò)程。對(duì)于細(xì)胞成分，GO富集分析顯示上調(diào)基因富集于細(xì)胞中間體、核質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，下調(diào)基因富集于胞外區(qū)域、細(xì)胞外泌體和細(xì)胞外間隙；生物過(guò)程分析顯示上調(diào)DEGs主要參與DNA復(fù)制起始、微管運(yùn)動(dòng)和染色體分離，下調(diào)的DEGs參與氧化還原過(guò)程、細(xì)胞色素氧化酶P450代謝和外源物質(zhì)的代謝過(guò)程；分子功能分析顯示上調(diào)的DEGs主要能與ATP結(jié)合，下調(diào)的DEGs具有氧化還原酶活性，與血紅素和鐵離子結(jié)合等功能。KEGG分析表明，DEGs主要富集在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、視黃醇代謝、p53信號(hào)通路和細(xì)胞色素P450代謝等通路中。見(jiàn)表1。

表1 DEGs的GO富集和KEGG通路分析

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析 261個(gè)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)由221個(gè)節(jié)點(diǎn)(基因)和3 616條邊(相互作用)組成。采用MCODE工具確定了互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵模塊，并選取互作最復(fù)雜的模塊進(jìn)行生物過(guò)程分析。該模塊中DEGs的生物學(xué)過(guò)程由BiNgo完成，主要富集于生物調(diào)控、細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞成分組織、代謝過(guò)程和信號(hào)調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程。見(jiàn)圖2。

注：A為261個(gè)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖；B為MCODE工具構(gòu)建的關(guān)鍵模塊；C為BiNgo分析關(guān)鍵模塊中DEGs的生物學(xué)過(guò)程。

2.4核心基因的分析 通過(guò)MCODE工具得到10個(gè)核心基因，分別是OIP5、HGFAC、CYP2C8、MT1M、GLS2、FCN3、APOF、ADH1C、FLVCR1和SLC27A。其中，OIP5和FLVCR1為上調(diào)基因，HGFAC、CYP2C8、MT1M、GLS2、FCN3、APOF、ADH1C和SLC27A為下調(diào)基因。另外，生存分析結(jié)果表明，F(xiàn)LVCR1的表達(dá)與肝癌患者的總體生存率和無(wú)病生存率有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，10個(gè)核心基因中，OIP5和HGFAC在PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度較高，對(duì)其進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，OIP5和FLVCR1的上調(diào)表達(dá)及HGFAC的下調(diào)表達(dá)與HCC分級(jí)、有無(wú)衛(wèi)星病灶、血管浸潤(rùn)程度有關(guān)系。見(jiàn)圖3、4。

注：A為總體生存率；B為無(wú)病生存率。

注：A為OIP5的表達(dá)與肝癌分級(jí)的關(guān)系；B為OIP5的表達(dá)與衛(wèi)星病灶的關(guān)系；C為OIP5的表達(dá)與血管浸潤(rùn)的關(guān)系；D為HGFAC的表達(dá)與肝癌分級(jí)的關(guān)系；E為HGFAC的表達(dá)與衛(wèi)星病灶的關(guān)系；F為HGFAC的表達(dá)與血管浸潤(rùn)的關(guān)系；G為FLVCR1的表達(dá)與肝癌分級(jí)的關(guān)系；H為FLVCR1的表達(dá)與衛(wèi)星病灶的關(guān)系；I為FLVCR1的表達(dá)與血管浸潤(rùn)的關(guān)系。

3 討 論

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了3個(gè)基因數(shù)據(jù)集(GSE101685、GSE84402、GSE46408)。共鑒定出261個(gè)基因，其中上調(diào)基因124個(gè)，下調(diào)基因137個(gè)。為了探究這些DEGs之間的相互作用，進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析。結(jié)果表明，這些上調(diào)的基因主要富集于細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、p53信號(hào)通路和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路等。說(shuō)明上調(diào)基因可能是通過(guò)影響細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制和調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)周期等過(guò)程，從而參與到HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。而下調(diào)基因主要富集于視黃醇代謝過(guò)程中。結(jié)合已有研究表明，肝癌患者的血清視黃醇水平與體檢者相比明顯下降[3]，證實(shí)了本研究發(fā)現(xiàn)的下調(diào)的DEGs可能參與到HCC患者的視黃醇代謝過(guò)程。

另外，本研究共鑒定出了10個(gè)核心基因，上調(diào)基因有OIP5和FLVCR1，下調(diào)基因有HGFAC、CYP2C8、MT1M、GLS2、FCN3、APOF、ADH1C、SLC27A5，這些基因有望成為HCC診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方式證實(shí)了CYP2C8在HCC組織中的低表達(dá)，與先前的研究結(jié)果一致[4-5]，表明CYP2C8在成為肝癌相關(guān)標(biāo)志物的潛在價(jià)值，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。同樣，MT1M在肝癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)可能與啟動(dòng)子的甲基化和與miR-545-3p相互作用有關(guān)[6]。據(jù)研究表明，GLS2和其他標(biāo)志物組合可用于評(píng)估肝癌患者的預(yù)后情況[7]，與腫瘤分期、血管浸潤(rùn)和腫瘤大小等有關(guān)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)與Dicer蛋白相互作用，抑制Snail表達(dá)從而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[8]。FCN3和APOF在肝癌組織中表達(dá)均下調(diào)，推測(cè)其可能作為腫瘤抑制劑影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[9-10]。另外，在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者的ADH1C上調(diào)往往意味著預(yù)后較好，但其具體的作用機(jī)制還不清楚[11-13]。SLC27A5通常參與到脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和膽汁酸代謝過(guò)程。最新研究表明，SLC27A5通過(guò)DNA甲基化使其在肝癌患者中表達(dá)下調(diào)，參與到KEAP1/NRF2代謝通路從而影響肝癌患者的進(jìn)展和預(yù)后[14]。

本研究中，OIP5和HGFAC在PPI網(wǎng)絡(luò)分析中具有較高的節(jié)點(diǎn)數(shù)，說(shuō)明這2個(gè)基因在所有差異基因相互作用過(guò)程中可能起著核心的作用。OIP5是一種腫瘤啟動(dòng)基因，在多種癌癥的發(fā)展過(guò)程中均有報(bào)道。本研究中OIP5在肝癌組織中是上調(diào)的，對(duì)其進(jìn)一步分析表明，OIP5的表達(dá)與肝癌分級(jí)，衛(wèi)星病灶和血管浸潤(rùn)有關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明OIP5影響HCC的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)動(dòng)物模型將裸鼠體內(nèi)OIP5敲低后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖和集落形成能力受到抑制，并促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡[15]。因此推測(cè)OIP5可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期和增殖能力等過(guò)程促進(jìn)HCC的進(jìn)展。HGFAC作為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活劑，能參與肝臟和胃的再生，抵抗多種類型的癌癥。本研究中HGFAC在肝癌組織中的下調(diào)表達(dá)，與肝癌分級(jí)、衛(wèi)星病灶和血管浸潤(rùn)有關(guān)。HGFAC表達(dá)下降可能受DNA甲基化的調(diào)控，并且HGFAC下調(diào)與肝癌患者不良的生存結(jié)果相關(guān)，因此HGFAC可作為肝癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，與本研究觀點(diǎn)相一致[16]。FLVCR1作為鐵代謝相關(guān)基因，其編碼蛋白是一種血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在鐵代謝過(guò)程中起著重要作用，能防止由過(guò)量鐵引起的氧化損傷[17]。本研究FLVCR1是對(duì)10個(gè)核心基因進(jìn)行生存分析后，唯一有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因，其表達(dá)水平升高預(yù)示著肝癌患者不良的預(yù)后。另外，在其他數(shù)據(jù)庫(kù)中也證實(shí)了FLVCR1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)的變化與預(yù)后情況相關(guān)，但其影響肝癌預(yù)后的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[18-19]。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選了肝癌相關(guān)的核心基因。其中，OIP5、HGFAC和FLVCR1與肝癌進(jìn)展有關(guān)系，可能成為肝癌診療和預(yù)后的生物標(biāo)志物。但其如何影響肝癌的進(jìn)展和預(yù)后尚需進(jìn)一步研究。