Exocyst復合物關鍵亞基Sec3蛋白在氣道黏液高分泌中的作用研究*

王 齊，周向東△，李 琪，鐘有清，王遠禮，胡基楊

海南醫學院第一附屬醫院：1.呼吸內科；2.檢驗科，海南?？?570102

氣道黏液高分泌為慢性氣道炎性疾病的重要病理特征，且長期氣道黏液高分泌狀態可引起黏液-纖毛清除功能障礙、肺功能進行性下降，最終導致病情惡化甚至死亡[1]。黏蛋白是一類具有形成凝膠能力的糖蛋白，其中氣道黏蛋白5AC(MUC5AC)主要分布于氣道，參與氣道黏液形成[2]。已有研究表明，MUC5AC過度生成和分泌是導致氣道黏液高分泌的重要原因之一[3]。另有研究指出，炎癥介質、香煙煙霧、冷空氣刺激等因素可增加MUC5AC的合成，同時亦可促進其胞外極向分泌[4]。因此猜想，氣道黏液高分泌與MUC5AC的病理性胞外分泌有關。Exocyst復合物是介導細胞內蛋白極性胞外分泌的關鍵因子，廣泛分布于組織和器官中，其中Sec3穩定定位于分泌活躍區細胞質膜上，常作為細胞分泌位點空間標志物[5]。患者氣道有慢性炎癥時，氣道上皮杯狀細胞數量及MUC5AC水平明顯高于健康人群，變應原等刺激引發急性發作時，胞質中MUC5AC儲備量無法在短時間內進一步升高[6]。故猜想，急性發作引發的氣道黏液高分泌可能與胞內分泌活躍區極性誘導MUC5AC出胞有關。人中性粒細胞彈性蛋白酶(HNE)為目前已知的促氣道黏液分泌因子[7]。本研究采用香煙煙霧暴露法建立慢性支氣管炎癥的病理性改變，然后利用HNE攻擊，從而形成氣道黏液高分泌大鼠模型，同時以人正常支氣管上皮細胞作為細胞模型，探討了Exocyst復合物關鍵亞基Sec3蛋白在氣道黏液高分泌形成過程中的作用及機制，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與細胞 SD大鼠60只，SPF級，成年雄性，體質量250～300 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號SCXK(豫)2017-0001。人支氣管上皮細胞(16HBE)購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0249。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640培養基(貨號PM150110)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；玉溪牌香煙，焦油量12 mg，含尼古丁1.2 mg，含CO 12 mg，購自紅塔煙草集團有限責任公司；HNE(貨號4716)購自上海齊一生物科技有限公司；糖原過碘酸-雪夫氏(PSA)染色試劑盒(貨號G1281)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、HRP標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗體(貨號SE134)均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗MUC5AC單克隆抗體(貨號ab198294)、鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號ab8226)均購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒(貨號AR1022)購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗Sec3單克隆抗體(貨號sc73353)購自美國Santa Cruz公司；反轉錄試劑盒(貨號205111)購自上海玉博生物科技有限公司；One-Step SYBR實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(貨號QPG-20)購自北京世聯博研科技有限公司；ECL發光液(貨號WBKIS0100)購自上海利翰生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1氣道黏液高分泌大鼠模型構建 采用香煙煙霧暴露法建立慢性支氣管炎癥的病理性改變，HNE攻擊形成慢性氣道炎癥急性發作。適應性飼養大鼠1周后，將大鼠隨機分為正常對照組、煙霧暴露組、煙霧暴露+HNE組，每組各20只；置于40 cm×30 cm×20 cm有機玻璃箱，箱頂部和四周各有5個圓形通氣孔，直徑為2 cm；點燃香煙后放入玻璃箱，每次5支，每天2次，持續12周；實驗前3 d煙霧暴露+HNE組給予香煙煙霧刺激的同時給予HNE沖擊，生理鹽水配置為100 U/mL溶液，以超聲霧化器霧化吸入，每次1 h，每天1次，誘導急性發作。

1.3.2PAS染色 麻醉大鼠后，經肺門至肺邊緣進行橫切，取支氣管肺組織，長約2～3 mm，4%多聚甲醛固定48 h；常規脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，制備厚度5 μm切片；按照糖原PSA染色試劑盒說明書操作，400倍下顯微鏡觀察染色情況，隨機選取直徑在500～1 000 μm的支氣管腔區域，測量玫紅色染色面積，以其占該區域總面積比例反映氣道上皮杯狀細胞增生程度；Image ProPlus軟件計算選定區域積分吸光度值，反映黏液分泌量。

1.3.3免疫組織化學(IHC)染色 取肺組織石蠟切片，脫蠟、水化后，滴加一抗，4 ℃過夜孵育；PBS緩沖液清洗，每次5 min，共3次；滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；PBS緩沖液清洗，每次5 min，共3次；DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察染色情況，以氣道上皮細胞膜或細胞質棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色，隨機選取6個視野，Motic Fluo軟件定量分析，測定吸光度值，反映蛋白相對表達水平。

1.3.4細胞培養及處理 細胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，每天更換1次培養液；細胞密度達80%時進行傳代，隨機分為16HBE組和16HBE+HNE組；取對數生長期細胞，16HBE+HNE組給予HNE(1 000 ng/mL)處理24 h，16HBE組以等體積DMEM培養基處理，再次置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養。

1.3.5細胞轉染 將細胞分為16HBE+HNE組、空質粒轉染組和sh-Sec3組，由上海生工生物工程有限公司設計并合成sh-Sec3和無義序列，上游序列：5′-GATCCAGTGTAATCGGTACAT-3′，下游序列：5′-ACGTTAAAGTGGTACATGATT-3′；將sh-Sec3和對照shRNA分別加入Lipofectamine 2000溶液，每組設置6個復孔；72 h后收集細胞，檢測Sec3蛋白及mRNA相對表達水平。

1.3.6蛋白免疫印跡實驗 取對數生長期細胞，收集于離心管內，預冷RIPA裂解液，反應1～2 s；4 ℃離心15 min，取上清液；瓊脂糖凝膠電泳分離蛋白，濕法轉至聚偏二氟乙烯膜；膜封閉液反應1 h，分別加入Sec3、p-Sec3、MUC5AC抗體，稀釋比例為1∶500，β-actin抗體，稀釋比例為1∶1 000，室溫孵育2 h；PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；滴加HRP標記山羊抗兔IgG抗體，稀釋比例1∶1 000，室溫孵育2 h；采用ECL發光液，暗室曝光，拍照保存，Image J軟件進行半定量分析。

1.3.7RT-PCR 取對數生長期細胞，提取細胞總RNA，定量和純化后，反轉錄為cDNA；按照One-Step SYBR RT-PCR試劑盒說明書操作，進行PCR擴增。Sec3上游引物：5′-CCAACCGTTGAGGCCACCA-3′；下游引物：5′-CCTAGTGGAACGTGGCACT-3′。MUC5AC上游引物：5′-ATGACCCTGGTACACACCC-3′；下游引物：5′-CGTACGTTTACAAACCCTG-3′。GAPDH為內參，上游引物：5′-GATGCGTGTGCTGAG TATG-3′；下游引物：5′-CAGTCATGGGTAACCATGC-3′；采用2-ΔΔCt法計算Sec3和MUC5AC的mRNA相對表達水平，實驗重復3次。

1.3.8免疫共沉淀 取對數生長期細胞，加入RIPA溶液，冰上裂解30 min；滴加Sec3抗體，4 ℃搖床過夜；以10∶1比例將蛋白樣品和50%瓊脂糖蛋白A混勻，4 ℃搖床10 min；混合液中滴加Sec3抗體，4 ℃搖床孵育2～4 h；4 ℃下3 000 r/min離心3 min，棄上清液；裂解緩沖液沖洗3次，每次5 min；加入2×SDS上樣緩沖液，沸水浴煮沸5 min；同步驟選用MUC5AC抗體，最終進行蛋白免疫印跡試驗，分析Sec3與MUC5AC的相互作用。

2 結 果

2.13組大鼠氣道上皮杯狀細胞增生及黏液分泌比較 與正常對照組比較，煙霧暴露組和煙霧暴露+HNE組大鼠氣道上皮杯狀細胞增生，黏液分泌量增加，且煙霧暴露+HNE組變化更明顯；與煙霧暴露組比較，煙霧暴露+HNE組大鼠氣道上皮杯狀細胞增生，黏液分泌量增加，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 3組大鼠氣道上皮杯狀細胞增生及黏液分泌量比較

注：A為正常對照組；B為煙霧暴露組；C為煙霧暴露+HNE組。

2.2大鼠氣道上皮杯狀細胞Sec3和MUC5AC蛋白的表達 與正常對照組比較，煙霧暴露組和煙霧暴露+HNE組大鼠氣道上皮杯狀細胞Sec3和MUC5AC蛋白相對表達水平明顯升高，且煙霧暴露+HNE組變化更明顯(P<0.05)。見圖2、3。

2.3HNE對氣道上皮杯狀細胞Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表達的影響 與16HBE組比較，16HBE+HNE組氣道上皮杯狀細胞的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)，且呈時間依賴性。見表2。

注：A為正常對照組；B為煙霧暴露組；C為煙霧暴露+HNE組。

注：A為正常對照組；B為煙霧暴露組；C為煙霧暴露+HNE組。

表2 HNE對氣道上皮杯狀細胞Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表達的影響

2.4轉染后Sec3蛋白和mRNA相對表達水平比較 與16HBE+HNE組和空質粒轉染組比較，sh-Sec3組細胞Sec3蛋白和mRNA相對表達水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 轉染后Sec3蛋白和mRNA相對表達水平比較

2.5Sec3對HNE誘導的16HBE中MUC5AC分泌情況的影響 與16HBE+HNE組和空質粒轉染組比較，sh-Sec3組細胞MUC5AC蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.05)，MUC5AC mRNA相對表達水平也降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 Sec3對HNE誘導的16HBE中MUC5AC 分泌情況的影響

2.6免疫共沉淀鑒定Sec3與MUC5AC的相互作用 利用Sec3抗體和MUC5AC抗體進行蛋白免疫印跡實驗，結果顯示Sec3蛋白可被MUC5AC抗體共沉淀，MUC5AC蛋白亦可被Sec3抗體共沉淀，且在HNE刺激下，這種相互作用可明顯加強。見圖4。

注：a為陽性對照組(沉淀前總蛋白)；b為16HBE組；c為16HBE+HNE組；d為陰性對照組(小鼠IgG沉淀)；A為以Sec3抗體進行沉淀，MUC5AC蛋白進行蛋白免疫印跡實驗；B為以MUC5AC抗體進行沉淀，Sec3蛋白進行蛋白免疫印跡實驗。

3 討 論

慢性呼吸系統疾病為臨床常見疾病，且為我國居民死亡的主要原因之一。在大氣污染和吸煙等因素影響下，慢性呼吸系統疾病的發病率呈逐年上升趨勢[8]。氣道黏液高分泌為呼吸道常見病理改變，尤其在慢性氣道炎癥疾病急性發作時，氣道黏液分泌可表現為異常高分泌[9]。氣道黏液高分泌可致氣流受限、肺泡表面活性物質降低、氧自由基產生，參與慢性氣道炎癥疾病進展，影響預后[10]。有研究表明，哮喘、慢性阻塞性肺疾病等慢性呼吸系統疾病中均有黏蛋白的過度表達，其中MUC5AC與氣道黏液高分泌的形成密切相關[11]。另有研究發現，在慢性氣道炎癥急性發作時，支氣管上皮細胞MUC5AC的表達上調可能與其胞外分泌有關[12]。對于大多數真核細胞而言，胞外分泌為極性分泌過程，受Exocyst復合物調控。近年研究發現，Exocyst復合物可在極化上皮細胞中高度表達，在細胞極性建立和協調極化囊泡向特定膜區域運輸中發揮重要作用[13]。但其參與氣道黏液高分泌過程的具體機制尚未完全明了。

本研究利用香煙煙霧暴露法構建慢性支氣管炎癥的病理性改變，結果大鼠氣道上皮杯狀細胞增生，黏液分泌量增加，MUC5AC蛋白表達增加，提示模型構建成功，符合以往報道結果[14]，表明MUC5AC高表達參與了慢性支氣管炎癥病理過程。HNE為中性粒細胞分泌的酶類蛋白質。已有研究證實，HNE與哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多種呼吸系統疾病急性發作密切相關，且為重要的促黏液分泌因子[15]。本研究利用HNE處理慢性支氣管炎癥大鼠模型，結果發現與單純煙霧暴露比較，HNE處理后可刺激氣道上皮杯狀細胞增生，黏液分泌，進一步上調MUC5AC蛋白水平，提示模型構建成功，符合以往報道結果[16]，表明HNE可刺激氣道上皮杯狀細胞的MUC5AC高分泌。Sec3為Exocyst復合物構成亞基之一，可不完全依賴囊泡轉運途徑到達細胞質膜分泌位點。研究發現，Sec3可能是Exocyst復合物介導的極性胞外分泌過程關鍵亞基[17]。本研究結果顯示，慢性炎癥大鼠模型中，氣道上皮細胞中Sec3表達增加；此外，在HNE處理的16HBE中，Sec3表達也增加，表明Sec3參與氣道黏液高分泌過程。HNE處理16HBE后，Sec3的磷酸化水平升高，表明在HNE誘導的高分泌細胞模型中，不僅Sec3的總蛋白表達增加，其蛋白活性也增加。同時，經HNE處理的16HBE中的MUC5AC的蛋白表達水平升高，這表明Sec3與MUC5AC在氣道高分泌模型中的表達趨勢是一致的。

由于Exocyst復合物是介導細胞內蛋白極性的關鍵因子，Sec3又是細胞分泌位點空間標志物，并且在極化上皮細胞中高度表達，因此胞外分泌過程均受Exocyst復合物的調控，而且Sec3可能在上皮細胞胞外分泌過程中發揮重要作用。本研究結果顯示，采用sh-Sec3轉染16HBE，其Sec3蛋白表達水平降低，同時MUC5AC的蛋白表達也被抑制，這表明MUC5AC蛋白的表達可能受到Sec3蛋白的調控；而MUC5AC又與氣道黏液高分泌形成密切相關，因此可推論出Sec3可能參與了氣道黏液高分泌的病理形成過程。本研究免疫共沉淀實驗結果表明，Sec3與MUC5AC蛋白間存在著較為密切的相互作用，這也為Exocyst復合物亞基Sec3通過影響MUC5AC蛋白表達，進而調控氣道黏液高分泌的病理過程提供了新的實驗證據。

綜上所述，Sec3參與氣道黏液高分泌過程，且與MUC5AC在體內外環境中均具有相互作用，介導了HNE誘導的MUC5AC高分泌。Sec3有可能作為抑制MUC5AC合成，減輕氣道黏液高分泌的治療靶點。