EB病毒DNA載量與患兒機體免疫及肝腎功能的相關性研究*

王紅霞，張月華，劉 敏，陳小建，唐小燕

中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院/海口市人民醫院：1.兒科；2.中心實驗室，海南海口 570208

EB病毒(EBV)屬于皰疹病毒科γ亞科家族成員之一，是引起兒童呼吸道感染的重要病毒之一，相關研究表明，有將近90%的人群EBV都處于潛伏感染狀態，而EBV感染是呼吸道感染疾病的重要病原體，其在兒童支氣管炎、肺炎及上呼吸道感染疾病中較為常見[1]。EBV會感染B淋巴細胞，導致其永生化，其在心理應激條件下重新激活，減輕細胞免疫，EBV感染已被證實發生于多種疾病的子集當中，如癌癥及自身免疫性疾病等，亦會引起肝腎功能損傷[2]。年齡相對較小的EBV感染患兒的臨床癥狀大多不典型，但急性感染時病毒載量較高，可引起患兒急性肝功能衰竭，當患兒癥狀為消化系統、呼吸系統及血液系統癥狀時，會增加臨床診斷的難度，極易導致漏診情況的發生，致使患兒的治療時機被耽誤，影響患兒預后[3-4]。鑒于此，本文通過研究EBV感染患兒EBV-DNA載量與機體免疫狀態及肝腎功能的相關性，以期為EBV-DNA陽性患兒的臨床治療提供數據支持，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年5月本院收治的90例EBV-DNA陽性患兒為研究對象。納入標準：(1)符合EBV感染相關診斷標準[5]；(2)經實時熒光定量PCR確定EBV-DNA載量≥5×102copy/mL；(3)年齡5個月至9歲，病歷資料完整；(4)入院前尚未接受相關抗感染治療。排除標準：(1)伴有其他感染性疾病或免疫性疾病者；(2)因各種原因無法完成相關研究調查者。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患兒家屬均簽署知情同意書。按照EBV-DNA載量的差異進行分組[6]，分成低載量組(<5×104copy/mL)44例、中載量組(5×104～5×105copy/mL)24例和高載量組(>5×105copy/mL)22例，另選取同期于本院接受體檢的健康兒童50例作為對照組。低載量組中男患兒25例，女患兒19例；年齡5個月至9歲，平均(4.52±1.23)歲；疾病分布：上呼吸道感染28例，下呼吸道感染16例。中載量組中男患兒14例，女患兒10例；年齡6個月至9歲，平均(4.63±1.25)歲；疾病分布：上呼吸道感染15例，下呼吸道感染9例。高載量組中男患兒13例，女患兒9例；年齡6個月至9歲，平均年齡(4.54±1.28)歲；疾病分布：上呼吸道感染14例，下呼吸道感染8例。對照組中男29例，女21例；年齡7個月至10歲，平均年齡(4.60±1.27)歲。各組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，低載量組、中載量組、高載量組疾病分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集所有研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，分成1、2、2 mL置于無菌試管中，1 mL血標本加入含1 mL淋巴細胞，以2 000 r/min離心20 min，采集中間白色云霧狀細胞層保存用于檢測EBV-DNA載量；一份2 mL血標本用于檢測免疫指標，將另一份2 mL血標本置于抗凝試管中，30 min后以3 000 r/min離心10 min，取上清液保存，用于檢測肝腎功能指標。

1.2.2EBV-DNA載量檢測 (1)將白色云霧狀細胞層放入離心管內離心處理5 min，離心速度設置為12 000 r/min；(2)收集沉淀物加入50 μL的DNA提取液中進行充分混勻，100 ℃處理10 min，在離心后取上清液儲存備用；(3)接著進行PCR擴增反應。按以下順序：待測標本、陰性質控品、臨界陽性質控品、陽性質控品、定量參考品，吸取2 μL液體置入上樣孔中。反應程序：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，總共循環10次；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，循環30次；反應結束后對數據進行保存，再對熒光值進行調節并讀取結果，以記錄儀自動分析待測標本的病毒拷貝數，并保證陰性質控品不出現數值。

1.2.3免疫指標檢測 采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群，主要指標包括CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、并計算CD4+/CD8+；采用免疫比濁法測定免疫球蛋白(Ig)G、IgA、IgM水平，相關試劑盒購自浙江愛康生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4肝腎功能指標檢測 采用德國西門子ADVIA 2400型全自動生化分析儀(購自北京泰林東方商貿有限公司)及配套試劑盒檢測肝腎功能指標。肝功能指標包括：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBil)。腎功能指標包括：血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1各組免疫指標水平比較 從對照組、低載量組、中載量組到高載量組，CD3+T細胞、CD8+T細胞、IgM水平逐漸升高(P<0.05)，而CD4+T細胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐漸降低(P<0.05)；低載量組、中載量組、高載量組的IgG水平均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組免疫指標水平比較

2.2各組肝腎功能指標比較 從對照組、低載量組、中載量組到高載量組，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組肝腎功能指標比較

2.3EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標的相關性 EBV感染患兒EBV-DNA載量與CD3+T細胞、CD8+T細胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相關(P<0.05)，與CD4+T細胞、CD4+/CD8+、IgA均呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標的相關性

續表3 EBV-DNA載量與患兒免疫及肝腎功能指標的相關性

2.4EBV-DNA載量對患兒肝腎功能異常和免疫狀態的診斷價值 EBV-DNA載量對患兒免疫狀態異常預測的曲線下面積(AUC)為0.849(95%CI0.687～0.891)，靈敏度為85.46%，特異度為82.53%；對患兒肝功能異常預測的AUC為0.754(95%CI0.611～0.878)，靈敏度為82.20%，特異度為80.37%；對患兒腎功能異常預測的AUC為0.701(95%CI0.572～0.763)，靈敏度為79.24%，特異度為80.02%。見圖1。

圖1 EBV-DNA載量對患兒肝腎功能異常和免疫狀態的預測價值的ROC曲線

3 討 論

EBV又稱之為人類皰疹病毒4型，亦是首個進入人類視野中和腫瘤密切相關的病毒，全球范圍內約有95%左右的人群血清EBV陽性[7-8]。EBV-DNA載量檢測是目前臨床上用以診斷EBV感染較為理想的方式。相關研究表明，EBV會引發傳染性單核細胞增多癥，從而使得患者外周血異型淋巴細胞數增加，而兒童因呼吸系統及免疫功能尚未完全成熟，一旦感染EBV則會引發外周血淋巴細胞的異常改變[9-11]。EBV感染后病毒會產生不同的抗原，而此類抗原對應產生的抗體則會發揮不同程度的免疫保護功能[12-14]。另有相關研究證實，臨床上約有80%左右的原發性急性EBV感染患兒會出現肝功能損傷[15-16]，且隨著近年來相關研究的逐漸深入，在原發性急性EBV感染患兒中發現腎功能也存在損傷，值得臨床重點關注。

本研究結果發現，從對照組、低載量組、中載量組到高載量組，CD3+T細胞、CD8+T細胞、IgM水平逐漸升高，而CD4+T細胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐漸降低(P<0.05)；低載量組、中載量組、高載量組的IgG水平均高于對照組(P<0.05)，提示EBV感染患兒機體免疫功能受損。相關性研究結果顯示，EBV感染患兒EBV-DNA載量與機體免疫狀態存在一定的相關性(P<0.05)。表明隨著EBV感染患兒的EBV-DNA載量增加，其機體免疫功能隨之下降。馬穎等[17]研究也指出EBV感染會引起兒童T淋巴細胞免疫機能的異常。分析原因，筆者認為處在EBV裂解期與潛伏期抗原的特異性毒T淋巴細胞大量增殖并凋亡，僅少量的抗原特異性記憶T細胞隱藏在體內，在血液中不斷循環，當EBV再次增殖時，記憶T細胞會快速進入活化狀態，繼而產生更為快速、明顯的免疫應答，同時EBV感染會刺激B淋巴細胞分泌Ig，促使體液免疫反應的發生。EBV-DNA載量的增加在一定程度上反映了病毒復制更為活躍，患兒對EBV的抵抗能力更為低下[18]。ALT、AST主要存在于肝臟、心臟組織細胞中，當相應細胞受損時，細胞膜通透性增加，胞質內的ALT、AST釋放入血，導致血ALT、AST水平升高；肝臟對TBil的代謝起著重要作用，TBil水平可較好地反映肝功能；BUN、Scr、UA是臨床上評估腎功能的常用指標[19]。本研究結果顯示，從對照組、低載量組、中載量組到高載量組，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)，提示EBV感染患兒存在肝腎功能下降的情況，隨著EBV-DNA載量的升高，患兒肝腎功能下降越明顯。其中主要原因可能在于EBV-DNA載量的增加預示著病毒復制能力提高，繼而增加了肝腎功能異常的發生概率[20]。相關性分析結果顯示，EBV感染患兒EBV-DNA載量與CD3+T細胞、CD8+T細胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相關(P<0.05)，與CD4+T細胞、CD4+/CD8+、IgA均呈負相關(P<0.05)，進一步證實EBV-DNA載量與患兒的免疫功能、肝腎功能相關，EBV-DNA載量升高通過誘導T淋巴細胞大量增殖，以及引起間質性腎炎、IgA缺乏癥、腎病綜合征等疾病導致患兒肝腎功能下降。此外，本研究發現DNA載量對EBV感染患兒免疫狀態異常預測的AUC、靈敏度及特異度最高，而對腎功能損傷的預測價值相對最低，原因可能是因為患兒機體在發生EBV感染后，其免疫系統的有關功能被逐漸激活，而EBV-DNA載量升高往往直接預示著機體內原本平衡的免疫狀態被打破，因此更易預測患兒的免疫狀態異常。而肝臟具有較好的解毒作用，其可分泌出C-反應蛋白等時相反應蛋白間接地參與機體內的免疫炎性反應，因此DNA載量對肝功能損傷也存在一定的預測價值。而預測腎功能損傷的效果相對較弱的原因主要可能在于患兒的腎臟在遭受EBV感染后尿素氮及24 h蛋白尿等指標水平變化更為明顯。這也從側面反映了隨著EBV-DNA載量的增加及免疫功能的下降，EBV感染患兒肝腎功能損傷發生風險隨之升高。提示了在實際臨床工作中應予以患兒積極有效的抗病毒治療及增強其免疫功能，繼而達到預防肝腎功能損傷的目的。

綜上所述，EBV感染患兒EBV-DNA載量和機體免疫狀態及肝腎功能損傷密切相關，隨著EBV-DNA載量的逐漸增加，機體免疫功能及肝腎功能下降，EBV-DNA載量可作為預測EBV感染患兒免疫功能及肝腎功能的有效指標，具有一定臨床應用價值。