WT1基因在急性髓細胞性白血病微小殘留病檢測中的應用*

李乾鵬，曹榮旋，張俊英，孫艷花，王寶宏，冉學紅

山東省濰坊市人民醫院血液科，山東濰坊 261000

急性髓細胞性白血病(AML)是一類起源于白血病干細胞的造血系統惡性克隆性疾病，嚴重危害人類健康[1]。AML的發病率逐年上升，且5年生存率小于50%[2]。盡管AML的治療已取得較大進展，但由于疾病易復發、耐藥，導致多數患者最終治療失敗，其重要原因是微小殘留病(MRD)的存在，MRD是指白血病經誘導化療獲得完全緩解后體內殘留的白血病細胞，不易被化療藥物殺傷，是引起AML復發、耐藥的根本原因[3]。因此，精準檢測MRD具有重要的科學意義和臨床應用價值。融合基因檢測是監測MRD的重要手段之一，對于AML患者的診療及預后判斷具有重要意義，其中RUNX1-RUNX1T1和早幼粒細胞白血病蛋白(PML)/視黃酸受體(RAR)α(PML/RARα)是AML患者中較常見的融合基因，約占10%～20%[4-5]。腎母細胞瘤基因1(WT1)定位于人類染色體11q13，WT1在正常造血干祖細胞中呈低表達，在成熟血細胞中不表達。WT1在AML患者骨髓細胞中通常過表達，且與腫瘤負荷呈一定的相關性，為AML的生物標志物[6-7]，WT1亦是MRD檢測的有效指標。然而，關于WT1與融合基因(RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα)相關性研究及綜合應用兩者評估MRD的研究較少，需進一步探討。本研究通過檢測融合基因(RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα)和WT1轉錄本水平，以探討聯合檢測融合基因(RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα)和WT1對AML患者預后評估的價值。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2018-2020年于本院確診并完成RUNX1-RUNX1T1或PML/RARα和WT1基因聯合檢測的伴重現性遺傳學異常的196例AML患者為研究對象。其中男112例，女84例；年齡50(10，74)歲。所有患者經骨髓細胞形態學、細胞遺傳學、免疫表型及分子生物學檢查確診為AML。應用實時熒光定量PCR(qPCR)方法同時檢測RUNX1-RUNX1T1、PML/RARα和WT1轉錄本水平，將RUNX1-RUNX1T1或PML/RARα融合基因轉錄本水平為0%看作融合基因陰性組(139例)，包括AML伴RUNX1-RUNX1T1的患者46例，急性早幼粒細胞白血病(APL)伴PML/RARα的患者93例，將RUNX1-RUNX1T1且PML/RARα融合基因轉錄本水平均不為0%看作融合基因陽性組(57例)，包括AML伴RUNX1-RUNX1T1的患者37例，APL伴PML/RARα的患者20例。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法 收集新鮮骨髓液0.5～1.0 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，試劑Trizol為美國Invitrogen公司產品，常規法提取總RNA。應用羅氏Z480 qPCR儀進行檢測。白血病相關融合基因檢測試劑盒購自上海源奇生物醫藥科技有限公司，Trizol法提取總RNA后按照試劑盒說明書進行檢測。以ABL基因作為內參基因，目的基因的轉錄本水平以目的基因拷貝數/內參基因拷貝數的百分比來表示。

2 結 果

2.1WT1基因在融合基因陰性組、陽性組中的表達情況 融合基因陰性組患者的WT1轉錄本水平為0.096%(0.007%，1.990%)，融合基因陽性組患者WT1轉錄本水平為1.420%(0.100%，60.340%)；融合基因陰性組患者WT1轉錄本水平低于融合基因陽性組患者，差異有統計學意義(P<0.01)。其中，在融合基因陰性組中，AML伴RUNX1-RUNX1T1患者與APL伴PML/RARα患者的WT1轉錄本水平分別為0.096%(0.007%，1.990%)和0.095%(0.009%，1.240%)，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1、2。

圖1 融合基因陰性組患者與融合基因陽性組患者WT1轉錄本水平比較

2.2WT1基因在融合基因低表達組、融合基因高表達組中的表達情況 橫向檢測57例融合基因陽性組患者中每例患者的WT1和融合基因轉錄本水平，在40例融合基因轉錄本水平≥1%的患者中(融合基因高表達組)，38例患者融合基因轉錄本水平高于WT1轉錄本水平，占比95%；在17例融合基因轉錄本水平<1%的患者中(融合基因低表達組)，16例患者WT1轉錄本水平高于融合基因轉錄本水平，占比94%。由此可見，在融合基因高表達組，融合基因檢測MRD的敏感性高于WT1；在融合基因低表達組，融合基因檢測MRD的敏感性低于WT1，可聯合檢測融合基因和WT1，以此提高MRD的檢測深度。見圖3。

圖2 PML/RARα陰性患者與RUNX1-RUNX1T1

圖3 WT1基因在融合基因陽性組中的表達水平

3 討 論

AML是一類嚴重危害人類健康的造血系統惡性疾病，具有高度異質性的AML的治療已取得較大進展，但由于疾病易復發，導致多數患者最終治療失敗。AML的預后與患者遺傳學標志物、分子生物學特征、MRD等相關，MRD是影響AML預后和療效評價的重要因素[3]。伴重現性遺傳學異常的AML約占AML的30%，此類患者臨床表現獨特，預后相對較好，但仍有部分患者易復發，臨床治療困難[8]，因此，準確有效地動態檢測MRD具有重要的臨床應用價值。

RUNX1-RUNX1T1融合基因由t(8;21)(q22;q22.1)形成，AML伴RUNX1-RUNX1T1的發病率約占AML的12%～15%，且多見于FAB分型中的M2型，AML伴RUNX1-RUNX1T1通常預后良好，美國國家綜合癌癥網絡指南將此類型歸為低危組，高劑量化療或造血干細胞移植可取得較好療效，但AML伴RUNX1-RUNX1T1患者的臨床及實驗室特征、預后不盡相同[5,9]。研究發現臨床因素影響AML伴RUNX1-RUNX1T1患者的預后，多數初治AML伴RUNX1-RUNX1T1患者的白細胞水平不高，而白細胞水平升高者則預后較差[5,10]。另有研究報道，單RUNX1-RUNX1T1融合基因不會導致白血病的發生，RUNX1-RUNX1T1融合基因合并多種基因突變(如C-KIT、FLT3、NPM1、CEBPA)共同作用致使白血病的發生，即“二次打擊”學說，AML伴RUNX1-RUNX1T1患者合并C-KIT exon17、FLT3-ITD基因突變時，其預后較差，因而，對AML伴RUNX1-RUNX1T1患者進行全面精準地預后評估至關重要。PML/RARα融合基因由15號染色體上的PML基因與17號染色體上的RARα易位形成[4]。PML/RARα融合基因既能下調核酸適配子的表達，導致核體結構破壞，亦能募集組蛋白去乙酰酶和甲基化酶，以此增加共抑制復合物和視黃酸靶基因啟動子甲基化，進而影響髓系細胞分化、增殖、凋亡及DNA修復等生物學進程，使髓系細胞停滯于早幼粒細胞階段，繼而導致APL的發生[4,11]。PML/RARα融合基因是APL的關鍵驅動基因。APL具有獨特形態學和細胞遺傳學特征，臨床以嚴重的凝血異常為特征，約占AML的10%～15%，APL是首個針對腫瘤特異性標志分子應用靶向誘導分化治療并取得良好療效的惡性腫瘤[12]。APL的特異性標志分子PML/RARα融合基因是全反式視黃酸與砷劑的靶點，全反式視黃酸作用于PML/RARα融合基因的RARα基因，并誘導APL細胞分化成熟，砷劑能夠降解PML/RARα融合基因表達產物，并觸發APL細胞的凋亡機制。盡管多數APL患者治療效果較好，但仍有約10%～20%的APL患者復發[13]。因而，探尋APL復發的生物標志物具有重要的科學意義和臨床價值。綜上所述，探尋伴重現性遺傳學異常的AML復發難治的生物標志物仍具有重要的科學意義和臨床價值。通過對MRD精準的動態監測，早期發現復發難治征象，篩選并預測出可能復發的個體，對于復發干預措施的具體實施具有重要意義，能夠有效地預防疾病復發和改善患者預后。

本研究提示聯合檢測融合基因和WT1轉錄本水平，可提高MRD檢測的敏感性和準確性，能夠更好地評估白血病患者的預后和臨床發展趨勢。研究報道，WT1基因與白血病發生、發展相關，WT1基因在評估白血病患者預后及預測疾病發展趨勢方面具有重要應用價值。WT1基因是定位于11號染色體短臂的抑癌基因，在轉錄因子調控和調節組織發育中發揮重要作用，WT1基因參與骨髓髓系細胞增殖分化過程，WT1基因轉錄本水平與白血病原始細胞腫瘤負荷相關，是白血病細胞的腫瘤標志物[6]。約10%的AML患者存在WT1基因異常，包括框外缺失、框外插入、過早地終止密碼子等，WT1 mRNA高表達與AML預后不良相關[6,14]。WT1 mRNA在骨髓增生異常綜合征(RAEB)各亞型患者中的表達水平均高于健康者，且WT1表達水平隨著RAEB的疾病進展升高，并與RAEB或RAEB-t共同影響AML的發生發展[15]。初診時高表達WT1基因的AML患者3年總生存期僅為19%，而低表達者3年總生存期高達64%[16]。在AML患者誘導化療過程中，WT1基因轉錄本水平降低速率亦與患者預后相關，WT1基因轉錄本水平降低預示較好的總生存期和無病生存期[3]。AML伴RUNX1-RUNX1T1患者造血干細胞移植(HSCT)后，WT1轉錄本水平與累積復發率相關，WT1轉錄本水平>0.6%的患者3年累積復發率在28.4%～41.2%，WT1轉錄本水平≤0.6%的患者3年累積復發率在15.6%～16.2%[16]。WT1基因在健康骨髓細胞呈低表達狀態，有研究表明WT1基因在健康者骨髓細胞中表達上限為0.60%[17]。還有研究表明WT1基因在健康者骨髓細胞中表達上限為2.5%[18]。本研究發現，融合基因陰性組患者的WT1轉錄本水平為0.096%(0.007%，1.990%)；融合基因陽性組患者的WT1轉錄本水平為1.420%(0.100%,60.340%)，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。有研究表明，WT1基因與FCM-MRD聯合預測AML早期復發的靈敏度、特異度、有效性均高于WT1基因和FCM-MRD單獨檢測[19]。WT1基因高表達與FCM-MRD陽性是AML和急性淋巴細胞白血病(ALL)患者HSCT后復發的獨立危險因素，聯合檢測WT1基因與FCM-MRD可預測AML和ALL患者HSCT后的總生存期和無病生存期[19-20]。

綜上所述，MRD檢測手段的聯合應用能夠更精準地評估白血病患者的預后。本研究發現融合基因高表達組(融合基因轉錄本水平>1%)中融合基因轉錄本水平高于WT1轉錄本水平，融合基因低表達組(融合基因轉錄本水平<1%)中WT1轉錄本水平高于融合基因轉錄本水平，由此可見，在融合基因高表達組，融合基因作為MRD的敏感性高于WT1，在融合基因低表達組，融合基因作為MRD的敏感性低于WT1，因此，聯合檢測融合基因和WT1轉錄本水平，能夠提高MRD檢測的敏感性和準確性，以此更好地評估白血病患者的預后和臨床發展趨勢。本研究尚有不足之處，目標人群樣本數量受限，且數據來源于單中心。今后需積累更多樣本，以便提高研究的準確性與代表性，并加強多中心協作。