血漿PGD2檢測在胃癌診斷中的臨床價值*

黃 巖，張鋼強，王 錦，張 強

蚌埠醫學院第一附屬醫院檢驗科，安徽蚌埠 233004

有研究表明，胃癌患者5年生存率不到30%[1]。早期胃癌缺乏特異性的臨床表現，患者確診時多處于疾病進展期或晚期階段，這極大降低了胃癌患者的治療效果。目前臨床上用于胃癌篩查和診斷的方法主要有血清腫瘤標志物檢測、內鏡篩查、影像學檢查、免疫組織化學檢測及手術病理確診等。其中血清腫瘤標志物檢測最為安全、便捷，但是缺乏足夠的靈敏度和特異度[2]，所以尋找創傷較小且特異、靈敏的胃癌篩查和診斷方法是當下臨床科研工作者所面臨的重要課題。前列腺素D2(PGD2)是一種脂質激素類信號配體，主要以外周組織中的免疫調節劑被熟知，比如可引起氣道炎癥，抑制血小板聚集及引起外周血管舒張等。近年來，PGD2的抗腫瘤作用正逐漸被重視，但其在胃癌診斷方面的報道比較少見。本研究分別采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)與蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測胃癌患者血漿PGD2、前列腺素D2合成酶(L-PTGDS)與前列腺素D2受體(PTGDR2)表達水平，探討血漿PGD2水平在胃癌診斷中的臨床價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5-11月在本院就診的76例胃癌初診患者作為胃癌組；62例胃良性病變患者作為胃良性病變組，40例體檢中心體檢健康者血漿標本分作為健康組。胃癌組中男55例、女21例，平均年齡(56.34±7.44)歲，有賁門癌24例、胃體癌7例、胃竇癌25例、皮革胃癌4例及位置不明胃癌16例。76例胃癌患者中56例有胃癌發病位置資料，67例有胃癌細胞分化程度資料，63例有淋巴結轉移情況資料，60例有完整TNM分期資料，47例有腫瘤大小資料。胃癌的診斷通過組織病理學檢查確診，并且符合胃癌相關診療標準，就診前均未接受腫瘤相關治療。胃良性病變組中男43例、女19例，平均年齡(54.58±11.71)歲，有胃息肉32例，急性糜爛出血性胃炎10例，慢性非萎縮性胃炎20例，胃良性病變均由內鏡初診并經病理確診排除癌前病變及癌變。健康組中男28例、女12例，平均年齡(52.98±8.57)歲。胃癌組、胃良性病變組及健康組一般資料比較，差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集 采集受試者肘部淺靜脈血3～5 mL，肝素抗凝，4 000 r/min離心4 min，取上層血漿置于小心離心管內并編號，放入-40 ℃冰箱凍存備用。收集胃癌患者手術切除的胃癌組織標本、相匹配的癌旁組織標本(距離癌組織邊緣3 cm以外)及胃良性病變病患者的手術切除標本。所有組織標本均放入-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2ELISA PGD2檢測ELISA試劑盒購自上海生工生物工程公司，嚴格按照說明書操作。使用美國BioTek公司生產的多功能酶標分析儀(MB-850)，在450 nm處測定反應孔吸光度值，通過繪制標準曲線計算PGD2水平。

1.2.3Western blot 采用Western blot檢測癌組織、癌旁組織、胃良性病變組織中L-PTGDS及PTGDR2的蛋白表達水平。取出凍存的組織標本在液氮存在的條件下碾成粉末狀，立即加入制備好的含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，并置于冰上裂解30 min，裂解混合物充分勻質后，以10 000 r/min、4 ℃，離心15 min，收集全部上清液，按照BCA蛋白分析試劑盒操作說明書指導的方法檢測蛋白表達水平，根據標本的蛋白表達水平，取一定量的組織蛋白標本與相應的緩沖液按照一定體積比例混合后，于100 ℃沸水煮沸5 min，再加入12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。隨后進行常規的轉膜與封閉，再洗膜，每次10 min、洗3遍。隨后加入稀釋的一抗，置于4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天取出一抗孵育過的聚偏二氟乙烯膜，使用TBS洗3遍，每次10 min，隨后將聚偏二氟乙烯膜置于按一定比例稀釋的二抗溶液，室溫孵育2 h，按上述方式同樣洗膜3次，最后利用HRP基板可視化信號顯色并曝光與圖像的最終采集，并用MD Image Quant Software圖像分析軟件進行分析并記錄，最后采用內參GAPDH表達水平作為對照，L-PTGDS與PTGDR2蛋白表達水平通過以下公式來計算：L-PTGDS或PTGDR2蛋白條帶的吸光度值/相應GAPDH條帶的吸光度值。

2 結 果

2.1胃癌組、胃良性病變組與健康組PGD2水平比較 胃癌組血漿PGD2水平[(321.21±90.35)pg/mL]明顯低于胃良性病變組[(434.02±96.14)pg/mL]和健康組[(446.75±88.29)pg/mL]，差異有統計學意義(P<0.05)，而胃良性病變組與健康組血漿PGD2水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；3組PGD2水平組間比較，差異有統計學意(F=31.64，P<0.05)。

2.2胃癌患者血漿PGD2水平與臨床參數間的關系 有淋巴結轉移的胃癌患者PGD2水平低于無淋巴結轉移的胃癌患者(P<0.05)；細胞分化程度處于低分化的胃癌患者PGD2水平高于細胞分化程度處于中、高分化的胃癌患者(P<0.05)。血漿PGD2水平與胃癌細胞分化程度呈負相關(r=-0.279，P<0.05)。見表1。

表1 胃癌患者血漿PGD2水平與臨床參數間的關系

2.3血漿PGD2水平對胃癌的診斷效能 結果顯示血漿PGD2水平診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.808，靈敏度為72.9%，特異度為81.2%，最佳臨界值為350.89 pg/mL，見圖1。

圖1 血漿PGD2水平診斷胃癌的ROC曲線

2.4胃癌組織、癌旁組織及胃良性病變組織L-PTGDS與PTGDR2的蛋白表達水平比較 根據組織標本提取蛋白情況，最終從76例胃癌患者組織標本中篩選出符合Western blot法檢測要求的癌組織及其癌旁組織25例，從62例胃良性病變患者組織中篩選出20例標本。結果顯示，胃癌組織中L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達水平低于癌旁組織及胃良性病變組織(P<0.05)，而癌旁組織與胃良性病變組織比較，L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western blot法分析L-PTGDS、PTGDR2的蛋白表達水平

表2 胃癌組織、癌旁組織及胃良性病變組織L-PTGDS與PTGDR2蛋白表達水平比較

3 討 論

近年來，腫瘤干細胞(CSCs)理論的提出為腫瘤的診療提供了新的研究方向和切入點[3]。CSCs被認為是腫瘤組織的起始細胞，擁有高度的自我更新及分化能力[4]。其中CSCs的干性具有十分重要的意義，它與腫瘤的發生、耐藥、復發、轉移及上皮間質轉化等多種生物學行為緊密相關[5-6]。目前臨床研究已從部分腫瘤組織中分離出CSCs，如肝癌組織、卵巢癌組織、食道癌組織、乳腺癌組織及胃癌組織[7-11]。其中胃癌干細胞(GCSCs)在胃癌侵襲、轉移和復發方面的重要作用已得到部分研究證實[12-13]。盡管如此，GCSCs的調控機制仍不明確，因此，更好地了解其調控相關分子及可能機制是胃癌診療研究中的關鍵。

PGD2是環氧酶催化的一個重要產物，L-PTGDS則是PGD2合成的限速酶。PGD2通過結合DP1/DP2兩種膜受體而發揮生物學作用，其中DP2又名PTGDR2。目前研究不僅發現PGD2具有抗腫瘤作用，還發現PGD2與PTGDR2所組成的信號通路可能具有調控GCSCs生物學行為的潛能[14-16]，但具體機制并不明確。同時，PGD2及相關分子在胃癌臨床診療中的價值也有待探究。ALVES等[17]的研究顯示PGD2水平降低與死亡率、復發及對鉑類化療的耐藥性相關，PGD2表達水平與化療后病情進展的風險呈負相關。LIM等[18]研究表明L-PTGDS的過度表達與卵巢癌的進展有關，提示它具有成為女性卵巢癌早期診斷生物學標志物的潛在能力。SUN等[19]研究發現彌漫性大B細胞淋巴瘤中L-PTGDS低表達與不良預后相關。因此，在臨床腫瘤診斷中PGD2可能具有早期篩查及指示患者預后的潛力，有必要進一步研究PGD2在胃癌診斷中的價值。

本研究結果顯示，胃癌患者血漿PGD2水平降低，血漿PGD2在診斷胃癌時，有較高的靈敏度及特異度，可見血漿PGD2水平具有診斷胃癌的作用，并且還具備初步鑒別胃部病變性質的潛力。本研究還發現有淋巴結轉移的胃癌患者血漿PGD2水平低于無淋巴結轉移的胃癌患者，且血漿PGD2水平與胃癌細胞分化程度呈負相關(P<0.05)。低分化腫瘤細胞具有更強的侵襲性，更易發生轉移和擴散，最終影響患者的生存率。因此，血漿PGD2水平檢測可能具有反映胃癌患者預后的潛力。

有研究使用免疫組織化學法檢測了總共277份胃癌組織標本中L-PTGDS、PTGDR2的蛋白表達水平，結果證明了胃癌組織中有L-PTGDS與PTGDR2的陽性表達[20]。于是本研究分析了胃組織中L-PTGDS與PTGDR2的蛋白表達水平，結果發現胃癌組織中L-PTGDS與PTGDR2蛋白表達水平降低(P<0.05)。結合之前的研究結果推測，血漿PGD2水平降低可能與組織中蛋白表達的下調相關，該結果還提示了L-PTGDS、PGD2、PTGDR2組成的信號通路可能參與了胃癌發生過程的負調控[20]，進一步研究其下游調控機制顯得尤為必要。

綜上所述，胃癌患者血漿PGD2水平低于胃良性病變患者和體檢健康者，血漿PGD2水平檢測對胃癌的診斷具有一定的臨床價值；血漿PGD2水平與胃癌分化程度呈負相關，可協助臨床對胃癌患者預后的判斷。本研究可為進一步開展PGD2/PTGDR2信號通路相關蛋白參與胃癌發生發展的機制研究提供臨床基礎。但本研究仍存在局限性，如樣本數量較少，臨床資料不齊，分組統計不夠詳細；入組病例的排除條件不夠細致；只做了回顧性分析而缺少前瞻性研究，如復發、轉移及生存期的相關分析。以上這些均是將來需要繼續努力探索的方向。