高通量芯片檢測SLE家系成員自身抗體的臨床價值探討*

張 蘋，翟建昭，張乃丹，劉在栓，王洋一，唐鴻鵠，武永康，3△

四川大學華西醫(yī)院：1.實驗醫(yī)學科；2.風濕免疫科；3.門診部，四川成都 610041

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種導致多器官損傷的自身免疫性疾病，其特征是機體對自身抗原失耐受、產(chǎn)生自身抗體和免疫復合物，遺傳和環(huán)境因素的相互作用在其發(fā)病中占有很重要的地位[1]。目前SLE的診斷主要依靠臨床癥狀及血清學標志物的檢查，由于其臨床表現(xiàn)的多樣性及血清學標志物檢測陽性率的問題，致使SLE的早期診斷困難。遺傳因素對SLE致病作用的研究顯示，SLE家系患者的直系親屬比健康人群患病概率增加100倍[2]，并且同一家系的患者在易感基因的篩查中顯示出了較強的一致性。雖然至今已發(fā)現(xiàn)超過200種自身抗體[3]，但由于臨床應用的限制及特異度、靈敏度問題，只有約20種自身抗體在臨床上使用。抗原芯片作為一種高通量的自身抗體檢測方法，其檢測通量高(最多可同時檢測上千個自身抗體)、所需樣本量少，檢測靈敏度及精密度是酶聯(lián)免疫吸附試驗的4～8倍[4]，并可根據(jù)需求自主組合進行檢測，對于家系標本尤其適用。因此，本研究采用抗原芯片對3個SLE家系患者進行120種自身抗體的檢測，探討基于家系的自身抗體表達情況，希望能為SLE診斷提供更加完善、精準的路徑。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院確診的7例SLE患者(來自3個SLE家系)作為病例組，根據(jù)家系不同，將其分為SLE家系1組(3例)、SLE家系2組(2例)、SLE家系3組(2例)。3個SLE家系均由患病的非雙胞胎親姐妹組成。選擇家系1中未診斷為SLE的4名健康者作為對照組。確診SLE病例均符合美國風濕病學會1997年修訂的診斷標準[5]。采集研究對象無抗凝劑的外周血5 mL于真空采血管，2 h內(nèi)離心，分離血清置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2方法 自身抗體檢測：采用包被有120種自身抗原的OmicsArrayTM自身抗體檢測芯片進行檢測，使用Cy3標記的抗人免疫球蛋白(Ig)G抗體檢測血清IgG自身抗體水平，在532 nm處檢測熒光信號。為了分析自身抗體水平在SLE家系病例中的表達是否高于對照組，并且鑒別自身抗體在不同家系表達的差異，筆者使用自身抗原芯片檢測了120個自身抗體，并采用OmicStudio 在線云工具繪制高級熱圖(https://www.omicstudio.cn)，該工具使用R 3.6.1軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1家系圖譜結(jié)果 SLE家系1中的3例患者基本信息為病例1女、38歲，病例2女、36歲，病例3女、32歲；SLE家系2中的2例患者基本信息為病例4女、55歲，病例5女、43歲；SLE家系3中的2例患者基本信息為病例6女、18歲，病例7女、30歲；對照組中的基本信息為對照1女、20歲，對照2男、14歲，對照3女、13歲，對照4女、74歲。家系圖譜見圖1～3。

圖1 SLE家系圖譜1

圖2 SLE家系圖譜2

圖3 SLE家系圖譜3

2.2SLE家系與對照組自身抗體檢測結(jié)果熱圖比較 由圖可見，3個SLE家系病例的自身抗體檢測水平總體較對照組上調(diào)。見圖4。

2.3各SLE家系組與對照組IgG型自身抗體水平結(jié)果比較 為了研究不同遺傳背景的家系患者在自身免疫性抗體檢測中是否具有家族特異性，將SLE家系1組、SLE家系2組、SLE家系3組分別與對照組進行組間差異性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個自身抗體水平有差異，分別為抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗染色體DNA抗體、抗膠原Ⅵ抗體。與對照組比較，SLE家系1組中抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗染色體DNA抗體、抗膠原Ⅵ抗體水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014、0.014、0.004、0.049)；SLE家系2中抗ssDNA抗體水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)；SLE家系3組中抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗染色體DNA抗體、抗膠原Ⅵ抗體水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002、0.001、0.001、0.005)。見表1。

注：抗體反應熒光值與平均值相近的顯示為灰色，抗體熒光值高于平均值的，隨著抗體熒光值的升高顏色越趨近于黑色，相反越趨近于白色；熱圖左側(cè)為聚類分析結(jié)果，聚為一組的抗原具有相對一致的反應性，熱圖右側(cè)表示的是芯片包被的120種抗原名稱。

2.4各IgG型自身抗體水平結(jié)果比較 與對照組比較，SLE家系1、2、3組共有4種自身抗體水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，病例組共有8種自身抗體水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。除表1的4種自身抗體外，還檢測出了抗硫酸軟骨素C抗體、抗GP210抗體、抗U1-snRNP 68/70抗體、抗U1-snRNP C抗體。見表1、2。

表1 各SLE家系組與對照組IgG型自身抗體水平結(jié)果比較

表2 病例組與對照組IgG型自身抗體水平結(jié)果比較[ M(P25,P75)]

組別n抗硫酸軟骨素C抗體抗GP210抗體抗U1-snRNP 68/70抗體抗U1-snRNP C抗體病例組75.82(4.90,9.25)5.68(3.69,7.33)28.38(24.08,43.20)33.72(26.48,197.34)對照組 41.69(0.58,2.74)1.67(0.58,3.33)12.92(7.63,20.72)14.75(9.00,24.87)P0.0250.0330.0380.038

3 討 論

SLE是一種由遺傳因素作用且臨床異質(zhì)性明顯的自身免疫性疾病，其血清學特征是產(chǎn)生針對各種細胞內(nèi)和細胞外成分的循環(huán)自身抗體，包括蛋白質(zhì)、核酸、核蛋白、磷脂、糖蛋白和糖脂等[3]。SLE具有家族聚集性，家族患病史是其發(fā)病的危險因素，不同種族SLE家系患者的患病率不同[6]。由于同一家系遺傳背景相同，通過組合多種自身抗體來驗證血清學自身抗體在表達上是否存在家系內(nèi)的一致性，家系間的異質(zhì)性，尋找SLE診斷模型，有助于SLE的精準診斷。本研究使用高通量抗原檢測芯片，首先在遺傳背景不同的家系標本中進行檢測，共篩選出4種自身抗體，包括抗dsDNA抗體、抗ssDNA抗體、抗染色體DNA抗體、抗膠原Ⅵ抗體，結(jié)果顯示不同家系患者與對照組比較，顯示出自身抗體的差異性，表明不同家系之間可能存在異質(zhì)性。考慮到家系樣本量較少，筆者又將3個家系病例匯為一組作為病例組與對照組進行比較。結(jié)果表明，除了之前鑒定出的4種自身抗體外，還鑒定出了抗硫酸軟骨素C抗體、抗GP210抗體、抗U1-snRNP 68/70抗體、抗U1-snRNP C抗體等水平有差異的抗體。結(jié)果顯示，隨著樣本量的增加，可以發(fā)現(xiàn)更多SLE相關(guān)自身抗體。

SLE主要病理表現(xiàn)是產(chǎn)生大量自身抗體，如抗核抗體、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗核小體抗體、抗U1-RNP抗體、抗核糖體p抗體等。在SLE診斷中，主要檢測指標有抗dsDNA抗體，抗Sm抗體、抗磷脂抗體等。本研究篩查出了SLE診斷的相關(guān)抗體，如抗dsDNA抗體，也發(fā)現(xiàn)了一些與疾病致病可能相關(guān)而非常規(guī)檢測的抗體。

抗dsDNA抗體作為SLE診斷的經(jīng)典指標，已被納入SLE分類標準[7]及疾病活動指數(shù)指南[8]，70%～80%的SLE患者可檢測到抗dsDNA抗體，其中45%～50%的SLE患者表現(xiàn)為抗體高滴度[9]，其滴度與疾病活動度及器官損傷有關(guān)。抗dsDNA抗體可識別多種自身抗原，從而觸發(fā)細胞凋亡、炎性反應和組織纖維化[10]。ssDNA由dsDNA通過解鏈形成，抗ssDNA抗體在生物化學和抗原特性上與抗dsDNA具有一致性[11]。關(guān)于SLE患者在抗DNA抗體檢測的研究中顯示，抗ssDNA抗體對SLE的診斷靈敏度接近100%，與其他自身抗體聯(lián)合診斷，特異度可達到98%，因此曾被報道為檢測SLE靈敏度很高的指標[12]。由于抗dsDNA抗體診斷SLE特異度高，被用于SLE診斷的常規(guī)檢測指標，但其靈敏度較低，若聯(lián)合使用抗ssDNA抗體可增加SLE患者的檢出率。

本研究中抗膠原Ⅵ抗體、抗硫酸軟骨素C抗體、抗GP210抗體的檢測結(jié)果顯示了SLE家系的異質(zhì)性。膠原Ⅵ為膠原中的一種，幾乎存在于所有組織的細胞外基質(zhì)中，與皮膚、腎臟、神經(jīng)、血管和肌肉中基底膜密切相關(guān)，也分布于膠原纖維周圍，保護軟骨細胞免受壓力，同時膠原Ⅵ也可抑制細胞凋亡和氧化損傷，影響代謝，促進細胞生長[13]。研究顯示，在SLE患者中抗膠原Ⅳ抗體、抗膠原Ⅴ抗體與免疫反應有關(guān)，未發(fā)現(xiàn)抗膠原Ⅵ抗體與SLE的關(guān)系[14-15]。硫酸軟骨素是天然存在的糖胺聚糖，也是聚蛋白聚糖的一部分，被認為是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成部分[16]，硫酸軟骨素根據(jù)不同的硫化模式，主要分為4種類型，硫酸軟骨素C為其中的一種[17]，主要應用于關(guān)節(jié)炎的治療。抗GP210抗體是一種針對自身核膜成分的自身抗體，是定位于核孔的復合物，對原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷有高度特異性，有研究表明，抗GP210抗體的存在與關(guān)節(jié)炎的患病率有關(guān)[18]。上述3個指標與關(guān)節(jié)、軟骨損傷反應相關(guān)，而SLE是一種累及多器官損傷的疾病，因此，抗體陽性提示患者可能有潛在的關(guān)節(jié)損傷，患者應多注意關(guān)節(jié)疾病，定期復查，盡早干預。

研究表明，SLE患者會對染色體DNA起較強生物免疫反應，細胞凋亡率的增加會導致酶修飾核酸的釋放，這些修飾過的核酸被免疫效應細胞識別為外源抗原，從而觸發(fā)免疫應答[19]。抗U1-snRNP自身抗體在30%～40%的SLE患者和幾乎所有混合性結(jié)締組織病的患者中可檢測到，是混合性結(jié)締組織病良好的預測因子，但在SLE診斷中的特異度不高[20]。

由于自身抗體特異度、靈敏度的差異，患者遺傳背景、潛在患病因素的不同，不同家系之間的自身抗體譜不同，導致檢測工作量大。因此，筆者利用高通量抗原芯片檢測技術(shù)篩查出了與SLE相關(guān)性較好的指標，并且隨著納入樣本量的增加，篩查指標也隨之增多，顯示出了抗原芯片在自身抗體篩選方面的應用潛力。將篩選出的自身抗體作為SLE的聯(lián)合診斷指標，可提高疾病診斷的特異度和靈敏度。同時，針對相同遺傳背景的患者組合自身抗體進行檢測，可對家系內(nèi)未發(fā)病人群的疾病預測提供較好的支持。本研究納入病例數(shù)較少，因此還需大樣本的臨床試驗進行驗證。