143例Citrin缺陷導致新生兒肝內膽汁淤積癥患兒的血漿氨基酸譜分析*

梅慧芬，蔡燕娜，彭敏芝，盧致琨，林云婷，江敏妍，盛慧英，李秀珍，張 文

廣東省廣州市婦女兒童醫療中心遺傳與內分泌科，廣東廣州 510623

Citrin是線粒體內鈣結合天冬氨酸/谷氨酸的載體亞型2蛋白，主要功能是將線粒體內的天冬氨酸轉運至胞質，參與尿素循環。Citrin缺陷會導致患兒在嬰兒期出現新生兒肝內膽汁淤積癥(NICCD)，為常染色體隱性遺傳疾病，致病基因為SLC25A13[1]。該病首先在日本被發現，在日本、中國、韓國等亞洲國家及歐洲部分國家均有報道，東亞人群發病率較高，其中中國發病率為1/65，日本發病率為1/69，韓國發病率為1/112[2]。研究顯示NICCD在我國是各種伴氨基酸血癥的嬰兒肝內膽汁淤積癥的重要病因[3]。Citrin缺陷所致的NICCD患兒主要臨床表現為持續性黃疸、肝脾腫大、生長遲緩、低血糖、肝功能異常、凝血功能障礙、低蛋白血癥等。大多數患兒在1歲左右其臨床癥狀會消失，但是有近20%的患兒可逐漸進展為致命性的成人Ⅱ型瓜氨酸血癥(CTLN2)[4]。因此，NICCD患兒的早診斷，早治療對預防CTLN2意義重大。

NICCD患兒在發病期常會檢測到血漿氨基酸水平異常，表現為血漿瓜氨酸、鳥氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸水平升高。目前國內外大多采用干血濾紙片-串聯質譜法對11種氨基酸水平進行半定量分析，該法在篩查和診斷NICCD的準確性及可靠性上有待進一步評估[5-6]。有報道指出新生兒進行NICCD篩查時的檢出率低于40%[5]。如此低的檢出率與標本采集時間有關：NICCD患兒大多在1～4月齡才因黃疸被注意到，出生后3 d采集的標本可能檢測不到氨基酸譜的改變。目前NICCD的臨床診斷標準尚未確定，確診依賴于SLC25A13基因檢測。為了提高NICCD診斷的速度和靈敏度，本研究分析NICCD患兒與健康嬰幼兒、不明原因肝內膽汁淤積癥(INH)兒童血漿氨基酸譜改變特點，氨基酸水平與年齡、基因型的關系，旨在為臨床早期診斷NICCD提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2004—2019年在本院因嬰兒肝炎綜合征或膽汁淤積癥就診的143例NICCD患兒作為NICCD組。所有患兒均經SLC25A13基因測序，確定患兒存在純合或復合雜合致病突變。143例NICCD患兒發病年齡在3天至1歲，平均年齡(3.56±0.17)個月；男性患兒74例，占51.7%；女性患兒69例，占48.3%。隨機選取同期56例年齡、性別相匹配的健康嬰幼兒作為對照組，年齡在1個月至1歲，經體格檢查、血常規、尿常規、大便常規、谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GGT)、總膽紅素(TBil)，直接膽紅素(DBil)、間接膽紅素(TBil)水平檢測結果均正常。選取同期49例年齡、性別相匹配的INH患兒作為INH組，排除先天性膽道閉鎖、中毒、感染和其他已知遺傳代謝性疾病(如進行性家族性肝內膽汁淤積癥等)，并經基因測序排除SLC25A13基因突變。本研究經本院醫學倫理委員會的批準，征得患兒法定監護人同意。

1.2儀器與試劑 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司1200系列，四元高壓泵，熒光檢測器)，氮吹儀(天津奧德賽恩斯儀器公司，MTN2800D-24)，流動相A為磷酸鹽緩沖液(美國安捷倫公司)，流動相B為甲醇、乙腈、水(美國西格瑪公司，HPLC級)，氨基酸混合標準品(美國西格瑪公司)，鄰苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯(美國安捷倫公司)，Lab-Aid 820核酸提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)，SLC25A13基因引物(北京六合華大基因科技有限公司)，TaKaRa Ex Taq?試劑盒[寶日醫生物技術(北京)有限公司]。

1.3方法

1.3.1血漿氨基酸水平分析 清晨空腹采集受試者外周靜脈血2 mL，采用乙二胺四乙酸二鈉抗凝，采集后2 h內冷藏送檢，常溫下3 000 r/min離心5 min，吸取血漿于-20 ℃冰箱保存待測。甲醇去蛋白，取上清液，氮氣吹干，水復溶后上機檢測。校準曲線采用氨基酸混合標準品進行校準，采用鄰苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯對血漿標本進行柱前衍生化，用C18反相氨基酸柱對血漿標本進行梯度洗脫和22種氨基酸水平分析[7]。

1.3.2SLC25A13基因突變 抽取患兒靜脈全血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，輕輕搖勻后-80 ℃冰箱凍存備用。采用核酸提取試劑盒提取患兒外周血基因組DNA，采用TaKaRa Ex Taq?試劑盒進行PCR擴增，反應體系為10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Ex Taq酶0.125 μL，加雙蒸水至總體積25 μL。擴增條件為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，循環35次；72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶，確定為目的條帶后，產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行Sanger直接測序，方法參考文獻[8]。

1.3.3各組氨基酸水平比較 比較各氨基酸在NICCD組、對照組、INH組間的水平差異。將所有受試者按年齡分為<6個月，6個月至1歲這兩個年齡段，比較不同年齡段各組氨基酸的水平差異，分析氨基酸與年齡的相關性；按突變類型分為純合突變組和復合雜合突變組，比較各氨基酸水平在兩組間的差異。

1.4統計學處理 采用SPSS20.0軟件對數據進行處理和分析。不呈正態分布的資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。對明顯升高或降低的氨基酸及比值進一步采用受試者工作特征(ROC)曲線分析。采用Pearson相關分析研究患者年齡與氨基酸譜水平的關系。

2 結 果

2.1143例NICCD患兒基因型結果 通過SLC25A13基因檢測發現68.5%(98/143)的患兒攜帶純合突變，31.5%(45/143)的患兒攜帶復合雜合突變。共檢出SLC25A13基因突變中有15種已知致病突變，其中c.851_854del、c.851_854del/c.1638_1660dup、c.851_854del/IVS6+5G>A為熱點突變，攜帶率分別為65.0%、11.9%、11.2%。見表1。

表1 143例NICCD患兒基因型結果[ n(%)]

2.2對照組、INH組、NICCD組22種氨基酸水平比較 與對照組、INH組比較，NICCD組患兒血漿中天冬酰胺、組氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸水平均升高(P<0.05)，瓜氨酸水平升高尤其明顯；谷氨酰胺和色氨酸水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 對照組、INH組、NICCD組22種氨基酸水平比較[ M(P25,P75)，μmol/L]

2.3對照組、INH組、NICCD組4種氨基酸比值比較 與對照組、INH組比較，NICCD組患兒血漿中瓜氨酸/絲氨酸、瓜氨酸/(亮氨酸+異亮氨酸)、蘇氨酸/絲氨酸明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 對照組、INH組、NICCD組4種氨基酸比值比較[ M(P25,P75)]

2.4<6個月、6個月至1歲部分氨基酸水平比較 與<6個月的NICCD患兒比較，6個月至1歲的NICCD患兒瓜氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平降低(P<0.05)；蛋氨酸、組氨酸水平升高(P<0.05)。見圖1。

續表2 對照組、INH組、NICCD組22種氨基酸水平比較[ M(P25,P75)，μmol/L]

注：Fischer Ratio為(纈氨酸+異亮氨酸+亮氨酸)/(酪氨酸+苯丙氨酸)；*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001；·為極端值；各年齡段從左至右依次為對照組、NICCD組、INH組。

2.5瓜氨酸與年齡的相關性 結果顯示瓜氨酸與年齡呈負相關(r=-0.31，P<0.01)。

2.6部分氨基酸及比值用于NICCD診斷的ROC曲線分析 對瓜氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、酪氨酸用于NICCD診斷的ROC曲線分析，曲線下面積(AUC)分別為0.986(95%CI0.974～0.998)、0.850(95%CI0.786～0.915)、0.899(95%CI0.849～0.949)、0.700(95%CI0.620～0.781)；最佳臨界值分別為66.40、70.75、329.55、111.00 μmol/L；靈敏度分別為91.0%、77.1%、82.6%、75.0%；特異度分別為98.0%、83.7%、87.8%、67.3%，見圖2A。對瓜氨酸/絲氨酸、瓜氨酸/(亮氨酸+異亮氨酸)、蘇氨酸/絲氨酸用于NICCD診斷進行ROC曲線分析，AUC分別為0.968(95%CI0.946～0.991)、0.984(95%CI0.970～0.998))、0.896(95%CI0.833～0.960)；最佳臨界值分別為0.415、0.465、1.785；靈敏度分別為91.0%、95.1%、88.9%；特異度分別為93.9%、95.9%、83.7%。Fischer Ratio的AUC為0.262(95%CI0.182～0.342)；靈敏度和特異度分別為44.4%、24.5%。見圖2B。

注：A為部分氨基酸用于NICCD診斷的ROC曲線分析；B為部分氨基酸比值用于NICCD診斷的ROC曲線分析。

2.7NICCD患兒純合突變組和復合雜合突變組天冬氨酸、谷氨酸水平比較 NICCD患兒純合突變組的天冬氨酸、谷氨酸水平比復合雜合突變組高(P<0.05)，見表4。

表4 NICCD患兒純合突變組和復合雜合突變組天冬氨酸、谷氨酸水平比較[ M(P25,P75)，μmol/L]

3 討 論

有研究發現NICCD患兒血漿多種氨基酸水平異常，包括瓜氨酸水平異常升高，可作為診斷NICCD的重要線索之一[1]。但是其他原因引起的肝病也可造成繼發性血漿氨基酸譜異常，因此要制訂NICCD氨基酸譜的診斷標準。本研究顯示與正常對照組、INH組比較，NICCD組患兒與尿素循環有關的氨基酸，包括鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸、天冬酰胺，天冬氨酸水平均明顯升高，谷氨酰胺水平降低(P<0.05)，與相關研究相符[6，9]。有研究表明，谷氨酸、谷氨酰胺水平降低與谷氨酸在三羧酸循環中的檸檬酸前體利用有關[10]。與對照組、INH組比較，NICCD組患兒生糖氨基酸，包括絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、蛋氨酸水平均明顯升高(P<0.05)，與相關研究相符[6，9]。NICCD組患兒甘氨酸、丙氨酸水平較INH組降低，可能與NADH大量堆積可抑制乳酸等還原物質的糖異生過程有關，也可能與檸檬酸缺乏時丙氨酸代謝成丙酮酸，從而導致NICCD患兒低血糖有關[11-12]。與對照組、INH組比較，NICCD組患兒生酮氨基酸包括賴氨酸、酪氨酸水平升高(P<0.05)，與相關研究相符[6]；與對照組比較，NICCD組患兒苯丙氨酸水平升高，但與INH組比較，NICCD組患兒苯丙氨酸水平無明顯變化，但NICCD組患兒色氨酸水平降低，可能與丙氨酸水平降低，需要色氨酸代謝補償作用有關[10]。

纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸這些支鏈氨基酸降解為琥珀酰輔酶A和(或)乙酰輔酶A，主要在骨骼肌中產生能量。SAHEKI等[12]報道NICCD患兒支鏈氨基酸水平降低。本研究中與對照組比較，NICCD組患兒纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸水平無明顯變化，可能與研究對象大部分年齡<6個月，處于疾病早期有關，未出現支鏈氨基酸分解代謝。NICCD患兒的異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸水平較INH組明顯降低，提示NICCD患兒支鏈氨基水平的特征性變化可能與患兒長期低血糖出現代謝補償作用有關[12]。本研究的NICCD患兒瓜氨酸水平與年齡呈負相關，與SAHEKI等[12]研究相符。但本研究NICCD患兒蘇氨酸水平在6個月至1歲較<6個月水平降低，而蛋氨酸水平在6個月至1歲較<6個月升高。CHEW等[13]研究發現，有部分患兒分別在14個月、16個月甚至在22個月蛋氨酸水平才出現緩解。因此，在分析氨基酸譜時，若瓜氨酸水平沒明顯升高，但蛋氨酸、蘇氨酸水平出現明顯變化仍需結合年齡考慮NICCD的可能，進一步行SLC25A13基因分析。

本研究顯示瓜氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、酪氨酸具有較好的診斷價值，能區分NICCD和其他疾病因引起的嬰兒膽汁淤積癥，與相關研究相符[9]。其中以瓜氨酸診斷價值最高，瓜氨酸水平為66.40 μmol/L時，靈敏度和特異度分別為91.0%、98.0%。TAMAMORI等[14]發現在進行新生兒篩查時瓜氨酸/絲氨酸、瓜氨酸/(亮氨酸+異亮氨酸)有更好的診斷價值。而本研究也發現瓜氨酸/(亮氨酸+異亮氨酸)的診斷價值較高。由此可見，氨基酸比值可提高診斷靈敏度和特異度。本研究共檢出SLC25A13基因突變15種，其中c.851_854del占比為65.0%，該突變目前在我國南方是SLC25A13突變攜帶者最常見的突變類型[2]。純合突變組的NICCD患兒天冬氨酸、谷氨酸水平較復合雜合突變組高(P<0.05)，其原因可能為不同的SLC25A13基因突變對Citrin蛋白功能造成的影響不同，下一步需從蛋白水平證實以上假設。

綜上所述，血漿氨基酸譜分析是篩查和診斷NICCD的一種靈敏、快速的方法，其中較為靈敏的診斷指標為瓜氨酸和瓜氨酸/(亮氨酸+異亮氨酸)；NICCD患兒瓜氨酸水平變化與年齡有關。