毛鉤藤堿對(duì)H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

丁露，馬羅平，孟明星，王磊，姜盛，關(guān)智敏，張廷彩，李娜

1.湖北文理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015；4.濰坊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)人民醫(yī)院 科教科，山東 濰坊 261000

心肌梗死作為冠心病中最嚴(yán)重的類型，是人類死亡的主要原因[1]。目前通過(guò)再通血管，恢復(fù)心臟血流，達(dá)到治療目的。但再通術(shù)后往往伴隨心肌損傷這一術(shù)后病理改變，被稱為心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷，嚴(yán)重影響再通后的治療效果[2-3]。研究表明，心肌I/R會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡，對(duì)心肌梗死病死率產(chǎn)生顯著影響[4]。因此，干預(yù)氧化應(yīng)激下心肌細(xì)胞發(fā)生的凋亡是提高心肌梗死治療效果，改善預(yù)后的重要手段。鉤藤是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有預(yù)防和治療心血管疾病的藥理作用，毛鉤藤堿（hirsutine,HS）作為其主要的生物成分，是一種新型生物堿單體化合物[5]。WU等[6]發(fā)現(xiàn)，HS具有保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷的作用。基于這一研究基礎(chǔ)，本研究將探討HS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧應(yīng)激損傷的影響及其作用機(jī)制，為其成為治療心肌損傷的化合物提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，放置在溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)繁殖，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2010-0044。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），膠原酶（美國(guó)Sigma公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）購(gòu)自上海碧云天公司，F(xiàn)luo-488-Tunel試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；BrdU購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3、Caspase 3、核因子E2相關(guān)因子-2（nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）、GAPDH抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)：將出生1～ 2 d的大鼠乳鼠浸泡于乙醇消毒后，開(kāi)胸取心臟，剪除心房洗盡血液，剪碎組織加入4 mL 20%的膠原酶消化3次，每次10 min，棄去前兩次細(xì)胞懸液，第3次消化后將細(xì)胞懸液離心，收集沉淀，DMEM重懸后，過(guò) 濾放置25T的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)2 h后，吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液加入BrdU（0.1 mmol/L）用于抑制成纖維細(xì)胞增殖，接種到新的培養(yǎng)板靜置培養(yǎng)。由于心肌成纖維細(xì)胞的貼壁速度和時(shí)間比較難掌握，受組織消化程度影響大，心肌細(xì)胞純度會(huì)有所差異。為控制原代細(xì)胞純度，待細(xì)胞幾乎全部貼壁后，篩選出狀態(tài)良好且自發(fā)搏動(dòng)細(xì)胞占總細(xì)胞85%以上的培養(yǎng)皿，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[7]。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立：采用終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液誘導(dǎo)細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型[8]。觀察加入的H2O2溶液1、 2、6、12、24 h后細(xì)胞狀態(tài)，確立本細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的最佳條件。

1.2.3 HS處理及分組：參考吳利新等[6]所用的濃度，加入不同濃度的HS處理原代心肌細(xì)胞，設(shè)為H2O2+0.1 μmol/L HS組、H2O2+1 μmol/L HS組、H2O2+ 10 μmol/L HS組、H2O2+100 μmol/L HS組，并設(shè)HS組（10 μmol/L）作為對(duì)照。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性：將細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。細(xì)胞存活率=加藥孔吸光度值/對(duì)照孔吸光度值×100%。

1.2.5 Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：制作細(xì)胞爬片，浸入4%的多聚甲醛室溫（15～25 ℃）固定20 min，按照試劑盒說(shuō)明，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照組，于熒光顯微鏡（Leica，DM-500）下拍攝圖片。采用 ImageJ軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 心肌細(xì)胞α-sarcomeric actin蛋白表達(dá)量的檢測(cè)：將制作的細(xì)胞爬片，浸入4%的多聚甲醛，室溫（15～25 ℃）固定20 min，用PBS清洗3次，加入α-sarcomeric actin一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，次日加入Fluo-488標(biāo)記的熒光二抗，孵育1 h。熒光鏡下進(jìn)行拍照并采集圖像。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白：用加入蛋白酶抑制劑的強(qiáng)效裂解液裂解細(xì)胞，制成蛋白上樣品，進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，然后用目的抗體按照一定比例稀釋后，4 ℃孵育過(guò)夜。次日用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。轉(zhuǎn)染上蛋白的膜采用化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍攝照片。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值來(lái)反映凋亡蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Prism Graph軟件分析作圖。正態(tài)分布數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞活力的影響 與Control組比，H2O2組在6、12和24 h細(xì)胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；最終選取400 μmol/L H2O2刺激12 h構(gòu)建原代心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型，見(jiàn)圖1A。與H2O2組比，HS濃度為1 μmol/L、10 μmol/L時(shí)可顯著增加細(xì)胞的活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；HS濃度為100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力反而顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1B。因此，選取10 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中HS的濃度。

2.2 HS對(duì)各組心肌細(xì)胞凋亡的影響 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與Control組比，HS組細(xì)胞無(wú)明顯變化，H2O2組細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核固縮，Tunel染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與H2O2組比，H2O2+HS組細(xì)胞核形態(tài)正常，Tunel染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 HS對(duì)各組心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 HS對(duì)心肌細(xì)胞α-sarcomeric actin的表達(dá)影響 對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行α-sarcomeric actin綠色熒光染色，與Control組比，H2O2組細(xì)胞染色結(jié)果提示，心肌肌節(jié)解聚現(xiàn)象明顯，心肌細(xì)胞橫紋肌結(jié)構(gòu)破壞；而H2O2+HS組此現(xiàn)象有所緩解，見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肌細(xì)胞α-sarcomeric actin表達(dá)的熒光染色

2.4 HS對(duì)各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 與Control組比，H2O2組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3比值顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與H2O2組比，H2O2+HS組Bax/Bcl-2、Cleaved-caspase 3/Caspase 3比值顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 HS對(duì)心肌細(xì)胞各凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 HS對(duì)心肌細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響 與Control組比，H2O2組心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與H2O2組比，H2O2+HS組心肌細(xì)胞Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 HS對(duì)各組心肌細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

鉤藤是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，臨床上作為羚角鉤藤湯、麻黃鉤藤散、天麻鉤藤飲、瀉肝安神湯等方劑的主要成分，可以用來(lái)治療哮喘、癲癇、高血壓等疾病。鉤藤中具有顯著藥理作用的主要是以鉤藤堿為代表的吲哚類生物堿[5]。隨著藥理學(xué)的發(fā)展，通過(guò)高效液相提取分離的方法可以從鉤藤堿中分離提取一種新型生物堿單體化合物即HS。HS是否與鉤藤一樣具有預(yù)防和治療心血管疾病的藥理作用，目前研究較少。WU等[6]發(fā)現(xiàn)，HS具有保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的心肌損傷的作用，其作用機(jī)制與抗氧化、減少心肌細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡有關(guān)。基于這一研究基礎(chǔ)，本研究探討HS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧應(yīng)激損傷的影響及其作用機(jī)制，為其成為治療心肌損傷的化合物提供理論依據(jù)。

氧化應(yīng)激與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，其所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷是疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一，嚴(yán)重影響了心肌梗死后血管再通后的治療效果[9]。因此，干預(yù)氧化應(yīng)激以減少心肌細(xì)胞損傷成為心血管疾病治療的研究熱點(diǎn)[10]。H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，是很成熟的構(gòu)建氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷模型的方法[8]。本研究提取大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，借鑒文獻(xiàn)方法[11]采用400 μmol/L H2O2處理原代心肌細(xì)胞，并設(shè)置了不同時(shí)間點(diǎn)，以確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)提取的原代心肌細(xì)胞對(duì)H2O2的耐受情況。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，400 μmol/L H2O2處理12 h，即能抑制細(xì)胞活力，也不會(huì)讓細(xì)胞大量凋亡，因此，采用 400 μmol/L H2O2處理12 h，作為本實(shí)驗(yàn)的氧化應(yīng)激損傷模型。同時(shí)，CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HS在1 μmol/L、 10 μmol/L濃度時(shí)均可顯著改善H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性降低的情況，0.1 μmol/L的濃度對(duì)細(xì)胞活性無(wú)顯著改善效果，而HS濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力反而下降。該結(jié)果說(shuō)明，HS可以保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷，且該保護(hù)作用呈現(xiàn)劑量依賴性，10 μmol/L時(shí)效果最佳。氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損傷作用主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡。本研究采用Tunel對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。結(jié)果顯示，HS具有抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用，與WU等[6]在缺氧誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞凋亡模型中的結(jié)果一致。前面有研究展示，HS可以調(diào)控IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[12]；可以通過(guò)ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β途徑誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞的凋亡[13]。這些研究中的HS的劑量分別達(dá)到20、40和60 μmol/L，本研究的有效濃度為10 μmol/L，濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)不僅失去保護(hù)作用且產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷。說(shuō)明HS的抗凋亡作用對(duì)濃度有極強(qiáng)的依賴性，不同濃度的藥理學(xué)效果甚至可以呈現(xiàn)出相反的效果。

α-sarcomeric actin是一種分布于肌節(jié)Z線處的細(xì)胞骨架蛋白，具有收縮功能，分布廣泛，主要存在于胚胎及新生動(dòng)物心肌中，是心肌細(xì)胞的特異性蛋白[14]。骨架蛋白的完整性可以確保心肌細(xì)胞功能的健全，本實(shí)驗(yàn)采用α-sarcomeric actin經(jīng)免疫熒光染色，以觀察心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。結(jié)果可以直觀看到HS逆轉(zhuǎn)了H2O2誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞肌節(jié)解聚的狀態(tài)，說(shuō)明HS對(duì)氧化應(yīng)激所致的大鼠心肌細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的損傷起保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，可分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑兩種：外源性途徑主要依賴于死亡受體（death receptor，DR），故又稱為死亡受體途徑；內(nèi)源性途徑主要依賴于線粒體的損傷，故又稱為線粒體途徑。目前已知，氧化應(yīng)激會(huì)觸發(fā)氧化呼吸鏈解偶聯(lián)，產(chǎn)生過(guò)量ROS，ROS積聚造成線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開(kāi)放，引起線粒體膜電位去極化，激活線粒體凋亡執(zhí)行通路，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax、Caspase 3以及Cleaved-caspase 3都是公認(rèn)的反映細(xì)胞凋亡活性的重要指標(biāo)。Bax/Bcl-2、Cleavedcaspase 3/Caspase 3比值增高，說(shuō)明細(xì)胞線粒體凋亡過(guò)程啟動(dòng)。本研究通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)了抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase 3的表達(dá)量，結(jié)果顯示HS可以下調(diào)Bax/Bcl-2，Cleaved-caspase 3/Caspase 3蛋白水平的上升，說(shuō)明其具有抑制線粒體凋亡啟動(dòng)作用。Nrf2/HO-1信號(hào)軸是調(diào)控氧化應(yīng)激性疾病的重要的信號(hào)通路，Nrf2可通過(guò)促進(jìn)下游HO-1發(fā)揮抗氧化作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與Control組相比，H2O2組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)受到抑制，而HS則能促進(jìn)Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)。說(shuō)明HS可能通過(guò)Nrf2/HO-1途徑發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)氧化應(yīng)激所致心肌細(xì)胞發(fā)生的線粒體凋亡。

HS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路抗氧化以抑制線粒體途徑凋亡的發(fā)生。