多巴胺D4受體二次重復(fù)等位基因型與注意缺陷多動障礙患兒視覺功能網(wǎng)絡(luò)的關(guān)聯(lián)性

錢安丹，陶潔潔，陳雙利，周榮輝，樓飛靈，王美豪

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）是一種通常在兒童和青少年時期診斷出的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，以注意力不集中和（或）沖動多動為特征，具有異質(zhì)性的臨床表型[1]。多巴胺D4受體（dopamine D4 receptor, DRD4）基因第3外顯子48 bp可變數(shù)目順向重復(fù)（variable number forward repetition,VNTR）被認(rèn)為是影響ADHD易感性的有力候選基因，有助于改善兒童該疾病的特異性診斷[2]。最近的研究證據(jù)表明DRD4二次重復(fù)等位基因（2R）作為亞洲人群中更常見的基因亞型，與ADHD風(fēng)險增加相 關(guān)[3]。DRD4不僅在人類大腦高表達(dá)，在視網(wǎng)膜也存在[4]，可能與視覺相關(guān)的異常更為密切。有研究表明，ADHD兒童更常被診斷為不同的視覺異常，包括屈光不正[5]、非典型眼球運(yùn)動[6]、視覺處理缺 陷[7]、色覺改變等。通過一些任務(wù)態(tài)腦功能研究發(fā)現(xiàn)，ADHD患兒較健康對照組在視覺認(rèn)知功能上也存在缺陷[8-9]，視覺網(wǎng)絡(luò)對該疾病的分類診斷有更高的精度[10]。因此，視覺相關(guān)網(wǎng)絡(luò)可能是ADHD患兒在遺傳和行為之間的通路上潛在內(nèi)表型之一，在遺傳和行為之間的通路上識別可以為ADHD的神經(jīng)病理機(jī)制提供重要的見解。

本研究采用獨(dú)立成分分析方法（independent component analysis，ICA）對DRD4不同基因型患兒的靜息狀態(tài)功能磁共振成像（resting state functional magnetic resonance imaging，rsfMRI）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，探索了視覺相關(guān)腦網(wǎng)絡(luò)的功能連接變化，比較了視覺網(wǎng)絡(luò)的功能連接與癥狀嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1 對象 2017年2月至2020年1月間，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院精神科招募了124例ADHD患兒，年齡6～15歲。ADHD診斷由3名經(jīng)驗豐富的精神科醫(yī)師按照《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第五版（DSM-V）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。兩名受試者根據(jù)以下排除標(biāo)準(zhǔn)被剔除：①有器質(zhì)性腦疾病史和伴有意識障礙的腦外傷史；②根據(jù)《學(xué)齡兒童情感障礙和精神分裂癥現(xiàn)用和終生版量表》（K-SADS-PL）有精神障 礙史；③根據(jù)中國修訂的韋氏智力量表，智商低于75；④曾接受過任何精神藥物治療；⑤藥物依賴或藥物濫用（包括海洛因、尼古丁或酒精成癮）。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床倫理委員會批準(zhǔn)。所有受試者自愿參與，并充分了解研究的目的、程序和潛在風(fēng)險，父母或監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書。入選兒童的父母完成了SNAP-IV評定量表（SNAP-IV）評估患兒的行為及癥狀嚴(yán)重程度[11]。入選患兒完成視聽整合持續(xù)性操作測驗（integrated visual and auditory continuous performance test，IVA-CPT）用于衡量視覺和聽覺方面的持續(xù)注意力、反應(yīng)控制等[12]，共獲得了6個指標(biāo)：綜合控制力/注意力商數(shù)、視覺控制/注意商數(shù)和聽覺控制/注意商數(shù)。

1.2 基因型測定 采集患兒靜脈血，用TIANGEN（DP304號）進(jìn)行基因組DNA分析，然后使用PCR和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat sequence，STR）方法對每個受試者的DRD4第3號外顯子的48 bp VNTR進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)以25 μL體積制備，每個體積包含12.5 μL KAPA2G快速復(fù)合混合物、1 μL正向引物（10 mmol/L）、1 μL反向引物（10 mmol/L）、1 μL模板DNA和9.5 μL ddH2O。樣品在95 ℃加熱10 min，經(jīng)歷多次循環(huán)后，最終在4 ℃下進(jìn)行延伸。將GS500LIZ標(biāo)準(zhǔn)樣品與PCR產(chǎn)物混合，進(jìn)行HIDI電泳，獲得STR圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)掃描 采用美國GE Signa-HDx 3.0Tesla磁共振掃描儀進(jìn)行全腦掃描成像。先采集T2加權(quán)圖像為排除顱內(nèi)結(jié)構(gòu)性病變，再使用回波平面成像序列（echo plane imaging sequence，EPI）采集rs-fMRI數(shù)據(jù)，成像參數(shù)如下：TR/TE=2 000/26 ms； FOV=192 mm×192 mm；矩陣=64×64；翻轉(zhuǎn)角度（FA）= 90°；層厚=4 mm；層間距=0 mm；層數(shù)33層；240個體積。在rs-fMRI掃描期間，要求所有受試者閉上眼睛，戴上海綿耳塞，盡可能保持靜止，保持清醒，避免思維活動。為確保患兒的安全，在監(jiān)護(hù)人的陪同下進(jìn)行全程掃描。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理 rs-fMRI數(shù)據(jù)預(yù)處理采用DPABI（http://rfmri.org/dpabi）和MATLAB平臺。預(yù)處理步驟包括：①剔除前10個掃描時間點(diǎn)；②時間校正；③頭動校正：去除頭部運(yùn)動三維平移超過3.0 mm 和（或）三維旋轉(zhuǎn)超過3°和（或）FD值（frame-wise displacement measurements，F(xiàn)D）不超過0.5的19個受試者數(shù)據(jù)；④圖像在空間上標(biāo)準(zhǔn)化為標(biāo)準(zhǔn)模板（montreal neurological institute，MNI），并重新采樣體素大小為3 mm×3 mm×3 mm；⑤標(biāo)準(zhǔn)化的fMRI數(shù)據(jù)用4 mm×4 mm×4 mm半高全寬（full width half-maximum，F(xiàn)WHM）高斯核進(jìn)行平滑處理，以適應(yīng)受試者間的解剖變異。

1.5 獨(dú)立成分分析 獨(dú)立成分分析是一種數(shù)據(jù)驅(qū)動的分析rs-fMRI數(shù)據(jù)的方法。采用fMRI工具包中的組ICA（MICA beta1.22，http://www.nitrc.org/projects/cogicat/）可獲得更穩(wěn)定的結(jié)果。MICA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的三個主要階段：①數(shù)據(jù)降維；②ICA算法的應(yīng)用；③每個個體的圖像與時間序列重建。在本研究中，采用SOI-GICA算法并進(jìn)行了100次GICA，根據(jù)之前的研究[13]，每個受試者獲得了30個獨(dú)立成分。對剔除成分的肉眼識別表明，它們可能與眼球運(yùn)動、頭部運(yùn)動或心跳引起的搏動有關(guān)。通過肉眼識別的金標(biāo)準(zhǔn)確定三個與視覺相關(guān)的組成部分，包括內(nèi)側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)（成分18）、枕極視覺網(wǎng)絡(luò)（成分22）、外側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)（成分15），這三個部分在網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)方面與先前的研究[13-14]高度一致。在進(jìn)行組間比較之前，獲取受試者特定的全腦空間地圖并轉(zhuǎn)換成Z分?jǐn)?shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 從所有受試者數(shù)據(jù)中提取這三個成分之后，采用MATLAB平臺中的REST對每一組人的三個成分分別用單樣本t檢驗產(chǎn)生各自腦網(wǎng)絡(luò)空間地圖的統(tǒng)計結(jié)果。單樣本的特定空間地圖作為后續(xù)兩樣本t檢驗分析的腦網(wǎng)絡(luò)模板。隨后，在去除性別、年齡和智商協(xié)變量之后，對每個成分的兩個基因組間差異進(jìn)行兩樣本t檢驗，閾值設(shè)定體素水平P＜0.05和團(tuán)塊水平P＜0.001（使用CDT多重比較校正）[15]。對人口統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行兩樣本t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗或卡方檢驗比較組間差異；臨床量表的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 103例受試者按基因型分為兩組（2R攜帶者組41例，其中36例2R/4R基因型，4例2R/2R基因型，1例2R/5R基因型；2R非攜帶者組62例，其中52例4R/4R基因型，2例4R/3R基因型，5例4R/5R基因型，3例4R/6R基因型）。兩組人群基因型處于Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。兩組在年齡（P=0.594）、智商（P=0.533）或性別分布（P=0.388）方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 DRD4 2R攜帶者組與2R非攜帶者組的臨床特征

2.2 不同DRD4基因型視覺功能網(wǎng)絡(luò)ICA功能連接強(qiáng)度的差異 以年齡、性別、智商作為協(xié)變量，DRD4 2R攜帶者組和2R非攜帶者組之間的差異為：與2R非攜帶者組相比，2R攜帶者組外側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)中右側(cè)顳枕葉（MNI峰值坐標(biāo)：x=33，y=-69，z=12）的連接強(qiáng)度趨于增強(qiáng)（P=0.003），右側(cè)中央前回（x=51，y=3，z=45）的連接強(qiáng)度下降（P＜0.001），右側(cè)扣帶回前部（x=3，y=21，z=42）的連接強(qiáng)度趨于下降（P= 0.001）。2R攜帶者顯示內(nèi)側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)中右側(cè)枕上回（x=21，y=-87，z=21）連接強(qiáng)度趨于增強(qiáng)（P=0.009），左側(cè)小腦上部（x=-27，y=-45，z=-21）的連接強(qiáng)度趨于下降（P=0.003），見圖1與表2。枕極視覺網(wǎng)絡(luò)中兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 DRD4 2R基因型攜帶者組與2R基因型非攜帶者組之間的視覺腦功能網(wǎng)絡(luò)連接差異

圖1 DRD4 2R基因型攜帶者組與2R基因型非攜帶者組之間的視覺功能網(wǎng)絡(luò)腦區(qū)差異（彩帶代表t值）

2.3 兩組顯著差異腦區(qū)（右側(cè)顳枕葉、枕上回）的功能連接強(qiáng)度與臨床量表的相關(guān)分析 在右側(cè)顳枕葉腦區(qū)，SNAP注意不集中評分與DRD4 2R攜帶者的功能連接強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.339，P=0.037），與2R非攜帶者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.308，P=0.016）。在右側(cè)顳枕葉腦區(qū)，視覺注意商數(shù)（r=-0.258，P=0.043）、視覺控制商數(shù)（r=-0.251，P=0.049）、綜合注意力商數(shù)（r=-0.262，P=0.040）與2R非攜帶者的功能連接強(qiáng)度均呈負(fù)相關(guān)，與2R攜帶者的功能連接強(qiáng)度呈無相關(guān)。在右側(cè)枕上回腦區(qū)，與以上量表值的相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，2R攜帶者較2R非攜帶者組ADHD患兒視覺相關(guān)腦區(qū)（右側(cè)顳枕葉、楔葉、枕葉上部）的功能連接強(qiáng)度趨于增高，可能與視覺感覺輸入的敏感性增加有關(guān)，與遺傳相關(guān)的脆弱性增強(qiáng)有 關(guān)[14]。最新全腦分析研究發(fā)現(xiàn)ADHD患兒早期視覺皮層腦區(qū)（距狀回、楔葉、舌回、枕葉上部）較正常兒童平均功能連接強(qiáng)度更高[16]。早期視覺皮層區(qū)域的連接強(qiáng)度增高可能與以下情況一致：ADHD患兒受到環(huán)境中視覺刺激的強(qiáng)烈影響，并被鎖定在這些刺激中，不是很容易關(guān)注非感官任務(wù)，如持續(xù)的表演任務(wù)。神經(jīng)生物學(xué)方法研究也發(fā)現(xiàn)使用高屏幕（電視、手機(jī)、電腦和電腦游戲）的青少年往往有較高的注意力缺陷風(fēng)險評分。

本研究同時發(fā)現(xiàn)2R攜帶者較2R非攜帶者視覺網(wǎng)絡(luò)右側(cè)中央前回的連接程度下降，右側(cè)扣帶回前部的連接程度趨于下降。有研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果：視覺工作記憶任務(wù)狀態(tài)下，ADHD患兒右側(cè)中央前回、兩側(cè)扣帶回前部激活減弱[17]；右側(cè)扣帶回白質(zhì)纖維束的微觀結(jié)構(gòu)變化與患兒該功能下降也密切相關(guān)[18]。 視覺過程是一個復(fù)雜且精心設(shè)計的過程，不僅包括初級視覺皮層及顳枕部視覺協(xié)助皮層，也包括與其他網(wǎng)絡(luò)之間的協(xié)調(diào)。扣帶回參與多種處理過程，包括注意過程，與許多大腦區(qū)域有聯(lián)系，可以彼此獨(dú)立地動態(tài)活動[16]。以往薈萃分析顯示ADHD患兒與注意力功能相關(guān)的腦網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出低激活[19]，本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)視覺網(wǎng)絡(luò)與額頂葉網(wǎng)絡(luò)間的腦白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)連接性降低[20]。

多動沖動癥狀隨著年齡的增加可得到一定的控制，但注意缺陷癥狀更加隱匿，可持續(xù)至成年。ADHD的動物模型之一，即DRD4基因敲除小鼠，對可卡因和甲基苯丙胺的反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)出局部運(yùn)動行為的增加，但注意缺陷癥狀的評估，在患病人群樣本上更易實(shí)現(xiàn)。近年研究發(fā)現(xiàn)視覺網(wǎng)絡(luò)在注意缺陷亞型的患者中變化更為顯著[21]，多動癥兒童視覺皮層腦區(qū)的功能連接性增加[22]，被認(rèn)為與ADHD患者的注意力缺陷相關(guān)[23]。ADHD有效的治療藥物哌甲酯可改善臨床癥狀，可顯著減少ADHD患兒視皮層區(qū)域的局部腦血流量[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，外側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)中2R攜帶者的右側(cè)顳枕葉腦區(qū)功能連接強(qiáng)度與SNAP注意不集中評分呈正相關(guān)，2R非攜帶者呈負(fù)相關(guān)；2R非攜帶者右側(cè)顳枕葉腦區(qū)功能連接強(qiáng)度與視覺注意商數(shù)、視覺控制商數(shù)、綜合注意力商數(shù)呈負(fù)相關(guān)；支持以往的研究成果[17-18，24]。而內(nèi)側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)的顯著差異腦區(qū)（枕上回）尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，提示外側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)對該癥狀的貢獻(xiàn)更大。外側(cè)視覺網(wǎng)絡(luò)主要分布于顳枕部視覺協(xié)助皮層，協(xié)助早期視覺皮層網(wǎng)絡(luò)對信息的處理。右側(cè)顳枕葉腦區(qū)為神經(jīng)發(fā)育障礙兒童面部識別的關(guān)鍵腦區(qū)[9]，也是視覺注意過程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與注意缺陷癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)，進(jìn)一步提示2R基因型有更顯著的注意缺陷癥狀，與先前研究[25]一致。

本研究尚存在一定不足與局限。首先，只有ADHD患兒被招募在本研究中，這限制了進(jìn)一步解釋本研究成果。將來的研究應(yīng)采用病例對照研究方法來驗證DRD4 2R基因型對ADHD的作用，并且提供更多有價值的臨床聯(lián)系。其次，由于部分實(shí)驗結(jié)果未通過多重比較矯正，結(jié)果只代表有變化趨勢，因此結(jié)論應(yīng)該謹(jǐn)慎。最后，盡管ADHD的表現(xiàn)形式和亞型分析之間可能存在著深刻的差異，但由于樣本量小和每組受試者數(shù)量不平衡，無法進(jìn)行亞型分析。盡管如此，DRD4 2R基因型對ADHD患兒視覺網(wǎng)絡(luò)的初步分析可為進(jìn)一步的深入研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

綜上所述，ADHD是復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，DRD4 2R基因型可影響視覺網(wǎng)絡(luò)中右側(cè)中央前回、顳枕葉等腦區(qū)。2R攜帶者患兒的視覺網(wǎng)絡(luò)中右側(cè)顳枕葉腦區(qū)功能連接增強(qiáng)，且與SNAP注意不集中評分呈正相關(guān)，而顯示出更顯著的注意缺陷癥狀。這一研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了對ADHD神經(jīng)病理機(jī)制的現(xiàn)有理解，從基因-腦-行為的研究過程探討ADHD的視覺功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)2R攜帶者的視覺網(wǎng)絡(luò)變化模式可能是注意力缺陷的神經(jīng)病理基礎(chǔ)之一。