內皮祖細胞外泌體抑制紫杉醇誘導的血管內皮細胞焦亡

王平，孟立平，劉龍斌，彭放

1.紹興市人民醫(yī)院（浙江大學紹興醫(yī)院） 心內科，浙江 紹興 312000；2.紹興文理學院附屬醫(yī)院（紹興市立醫(yī)院） 心內科，浙江 紹興 312000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease, CHD）的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。近年冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）飛速發(fā)展，但即便是最新型支架的出現也并未從根本上解決冠狀動脈支架內再狹窄（in-stent restenosis, ISR）的問題，在PCI患者中ISR總的發(fā)病率仍達3%～20%[1]。

紫杉醇可以通過抑制細胞有絲分裂和觸發(fā)細胞凋亡有效阻止細胞的增殖，被廣泛應用在腫瘤治療領域。由于紫杉醇可以抑制平滑肌細胞的增殖，有效抑制ISR的進展，近年來也被應用于冠脈內支架涂層。盡管紫杉醇藥物涂層支架被推廣使用，臨床醫(yī)師發(fā)現ISR的問題仍然存在。PCI術后支架表面快速的內膜化是減少急性和慢性IRS的關鍵[2]。隨著藥物涂層支架的不斷推廣，越來越多的學者注意到藥物涂層對內皮細胞的損傷是引起ISR的一個重要因素。過去WANG等[3]的研究結果顯示紫杉醇減低血管內皮細胞中血栓調節(jié)蛋白的表達，增加了支架術后血栓形成的風險。ZAMORA等[4]的研究發(fā)現紫杉醇還可以誘導內皮細胞的自噬，并最終導致內皮細胞的死亡。

細胞焦亡是近年來發(fā)現的伴隨炎癥反應的一種新型的程序性細胞死亡方式，在形態(tài)和病理生理機制方面都區(qū)別于凋亡和壞死，是機體一種重要的先天炎癥免疫反應，廣泛參與到感染性疾病、心血管疾病，以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中[5]。在本研究中，我們發(fā)現紫杉醇可以導致內皮細胞焦亡，并進一步證實內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs）來源的外泌體可以抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡。

1 材料和方法

1.1 材料 本實驗中采用的人臍靜脈血管內皮細胞系（HUVEC-12細胞）購自上海博湖細胞公司。胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；鈣黃綠素乙酰甲酯（Calcein-AM）購自杭州浩鑫生物公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑購自大連TaKaRa公司；CD34、CD44、CD90、VEGFR2、NLRP-3、IL-18、GSDMD-N抗體均購自美國Abcom公司，蛋白質印跡法（Western blot）相關試劑購自南通碧云天生物科技公司。

1.2 外泌體的提取與鑒定

1.2.1 骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）原代培養(yǎng)方法：選用4周齡Wistar雄性大鼠，麻醉處死，腹部皮膚消毒，分離后肢的雙側脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結締組織，無菌條件下剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5 mL注射器吸取LG-DMEM 培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于15 mL 離心管，低速離心1 000 r/min×5 min，棄上清液，以5 mL新鮮含20%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度以1×106個/mL進行接種，然后轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24 h后首次換液，去除未貼壁細胞，之后 每3天換液1次。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.2 EPCs原代培養(yǎng)方法：選用4周齡Wistar雄性大鼠，麻醉處死，腹部皮膚消毒，分離后肢的雙側脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結締組織，無菌條件下剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5 mL 注射器吸取PBS反復沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于15 mL離心管，低速離心1 000 r/min× 5 min，棄上清液，加入EGM-2-MV重懸細胞，調整細胞密度以1×106個/mL進行接種，然后轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2 d后棄去未貼壁的細胞，換入新的培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)已貼壁的細胞，之后3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.2.3 EPCs分泌的外泌體（EPCs-Exo）與BMSCs分泌的外泌體（BMSCs-Exo）的提取與鑒定：光鏡下觀察細胞形態(tài)，免疫熒光染色觀察細胞表面CD44、CD99、CD34及VEGFR-2的表達完成對BMSCs和ECPs的鑒定。收集BMSCs和EPCs的無血清培養(yǎng)基上清液，200×g，2 000×g和10 000×g差速離心法離心細胞上清液，再在110 000×g離心2 h，洗滌2次沉淀物用PBS重懸。外泌體的定量和濃度檢測由杭州聯(lián)川生物公司完成，是根據外泌體的粒徑分析得出外泌體的濃度為BMSCs 8.57×108Particles/mL，EPCs 2.85×109Particles/mL。BCA protein assay kit 測定外泌體蛋白濃度及RNA分析。透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。Western blot實驗檢測外泌體特征性標志物CD63和CD9的表達。

1.3 分組 HUVEC-12細胞分為對照組（使用普通培養(yǎng)基），紫杉醇組（使用5 nmol/L紫杉醇干預），紫杉醇+EPCs-Exo組（使用5 nmol/L紫杉醇+EPCs-Exo干預），紫杉醇+BMSCs-Exo組（使用5 nmol/L紫杉醇+ BMSCs-Exo干預）。

1.4 電鏡觀察外泌體形態(tài)及細胞超微結構 將所提取的外泌體或者經藥物干預后的細胞先后經2.5%戊二醛、1%鋨酸后固定，再經脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，制成60 nm超薄切片，經鈾、鉛雙重染色，在HITACH500透射電鏡（日本日立公司）下觀察血漿外泌體的形態(tài)及細胞超微結構。

1.5 細胞免疫熒光觀察細胞表面CD44、CD99、CD34及VEGFR-2的表達 將細胞接種于96孔板，每孔3 000～5 000個細胞，待細胞貼壁后，先PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25% Triton×100穿破細胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋了250倍的一抗抗體，4 ℃過夜，PBST清洗3遍之后加入結合有FICT或者FRICT的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h后PBST清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用Iamge Pro Plus 6.0分析。

1.6 Western blot檢測外泌體標志蛋白CD63、CD9和細胞焦亡相關蛋白NLRP-3、IL-18、GSDMD-N的表達情況 提取外泌體，加入500 μL蛋白裂解液離心去上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經電泳蛋白分離和轉膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，經Quantity One進行灰度測量分析。

1.7 測序分析及RT-qPCR檢測外泌體中LncRNA FGD5-AS1的表達水平 將提取的外泌體送至杭州聯(lián)川生物技術有限公司檢測進行非編碼RNA測序分析，得到表達差異的非編碼RNA。芯片檢測實驗流程按照美國Illumina公司提供的標準步驟執(zhí)行，包括制備文庫和測序實驗。小RNA測序文庫制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits（美國Illumina公司）試劑盒。文庫制備工作完成后，對構建好的文庫使用Illumina Hiseq2000/2500進行測序，測序讀長為單端1×50 bp。

TRIzol法提取各組細胞中的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行目的基因的擴增。LncRNA FGD5-AS1引物上游：5’-AGAAGCGGAGGGGTGAAAAT-3’，下游：5’-CCGCCTTATAGTTGGCCCTC-3’；以U6作為內參，引物上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應條件：預變性95 ℃，10 min，變性95 ℃，15 s，退火60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，各設置3個重復孔，結果以2-△△Ct方法分析。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS.20.0和GraphPad Prism7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，每組試驗重復3次，2組比較采用t檢驗，多組比較用單因素方差分析，兩兩比價采用LSD法。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs-Exo和EPCs-Exo的提取及鑒定 大鼠骨髓細胞中分離培養(yǎng)分化出BMSCs，經CD90和CD44免疫熒光鑒定；從BMSCs分化出EPCs，經CD34和VEGFR2免疫熒光鑒定（見圖1A）。采用超速離心法提取出外泌體，通過電子顯微鏡觀察外泌體的外形（見圖1B），并通過Western blot檢測了外泌體標志蛋白CD63和CD9的表達情況，發(fā)現提取的外泌體中CD63和CD9高表達，而細胞上清液中這兩種蛋白幾乎沒有表達（見圖1C）。

圖1 大鼠BMSCs和EPCs以及外泌體的成功提取和鑒定

2.2 EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡 為了驗證外泌體對紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡的影響，我們在用紫杉醇構建內皮細胞焦亡模型的基礎上，用所提取的外泌體干預內皮細胞。BMSCs-Exo和EPCs-Exo都能成功地進入內皮細胞膜，見圖2A。紫杉醇能夠引起內皮細胞變大變圓，細胞膜破裂，呈典型的細胞焦亡形態(tài)；而EPCs-Exo可以緩解紫杉醇的這一作用；BMSCs-Exo沒有這種緩解作用，見圖2B。Western blot結果顯示，相比于對照組，紫杉醇組細胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N等細胞焦亡蛋白表達增加（P＜0.05）；相比于紫杉醇組，紫杉醇+ EPCs-Exo組內皮細胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表達減少（P＜0.05）；紫杉醇組與紫杉醇+BMSCs-Exo組內皮細胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表達沒有明顯差異，見圖2C-D。電鏡結果顯示，紫杉醇對內皮細胞損傷嚴重，細胞內線粒體間距離增加，細胞內纖維排列紊亂；而EPCs-Exo可以減少紫杉醇對內皮細胞微觀結構的影響，見圖3。

圖2 EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡

圖3 電鏡觀察細胞超微結構

2.3 EPCs-Exo中富含LncRNA FGD5-AS1 基因芯片檢測BMSCs-Exo和EPCs-Exo中l(wèi)ncRNA表達情況，結果顯示包括lncRNA FGD5-AS1在內的多種lncRNA在BMSCs-Exo和EPCs-Exo中表達差異明顯，見圖4。之后我們進一步用RT-qPCR法驗證基因芯片顯示有差異的lncRNA FGD5-AS1在兩組外泌體之間的表達情況，發(fā)現lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中表達增加（P＜0.05），見圖5A。然后我們用RT-PCR法檢測經BMSCs-Exo和EPCs-Exo干預過的細胞模型中l(wèi)ncRNA FGD5-AS1表達情況，經EPCs-Exo干預過的內皮細胞中，lncRNA FGD5-AS1都明顯高于其他組（P＜0.05），見圖5B。

圖4 基因芯片篩選出BMSCs-Exo和EPCs-Exo中差異的lncRNA的表達情況

圖5 LncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中的表達

3 討論

本研究通過紫杉醇干預內皮細胞，發(fā)現紫杉醇可以誘導內皮發(fā)生細胞焦亡。紫杉醇作為一種細胞毒性藥物，一方面可以通過抑制平滑肌細胞的增殖和遷移從而降低ISR的發(fā)生，但是，紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡可能是紫杉醇藥物涂層支架使用后ISR仍沒有得到最終解決的原因之一。在紫杉醇抑制平滑肌細胞增殖的同時，如能有藥物保護其對內皮細胞的損傷，將可以進一步減少ISR的發(fā)生。

最近PARK等[6]的研究結果顯示，EPCs可以減少支架內血栓的形成，并最終降低ISR的發(fā)生。HUANG等[7]通過在支架表層涂抹可以捕獲EPCs的細胞因子，也證實了EPCs可以降低ISR的發(fā)生率，但是遺憾的是上述研究都沒有涉及EPCs在ISR中發(fā)揮作用的具體機制。外泌體是近年來發(fā)現的介導細胞間信號傳遞的重要介質，細胞內多種蛋白質和非編碼RNA被包裹進入外泌體中并向細胞外環(huán)境中釋放，進入靶細胞發(fā)揮相應的生物學功能。多項研究表明EPCs-Exo具有保護血管內皮功能，促進心臟血管微循環(huán)，抑制心肌纖維化等作用[8-9]。BMSCs-Exo對心血管系統(tǒng)的保護作用也是近幾年研究的熱點。在本研究中分別用BMSCs-Exo和EPCs-Exo干預經紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡模型，發(fā)現EPCs-Exo可以減少內皮細胞的焦亡，而BMSCs-Exo并無此作用。

為了進一步探索EPCs-Exo抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡的具體機制，我們通過對BMSCs-Exo和EPC-Exo進行高通量測序篩選，發(fā)現lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中的表達高于BMSCs-Exo，并通過RTPCR進一步證實了這一結果，提示FGD5-AS1對ISR可能具有一定的保護作用。目前關于FGD5-AS1的研究主要聚焦在腫瘤領域。FGD5-AS1可以通過調節(jié)miR-129-5p/HNRNPK軸，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進膠質母細胞的增殖能力[10]。在腎癌患者中，FGD5-AS1通過于miR-5590-3p，激活細胞內的ERK/AKT信號通路，從而促進腫瘤細胞的增殖[11]。上述研究結果均提示FGD5-AS1可促進細胞的增殖活性，基于此，我們推測EPCs-Exo可能是通過其中富含的FGD5-AS1發(fā)揮抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡的作用，我們將在后續(xù)研究中進一步驗證此假說。

綜上所述，本研究首次提出紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡可能是藥物涂層支架ISR發(fā)生率仍無法有效控制的原因。本研究從大鼠骨髓中培養(yǎng)出EPCs和BMSCs，并分離提取出EPCs-Exo和BMSCs-Exo，發(fā)現EPCs-Exo可以抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡，而BMSCs-Exo并無此作用，并進一步通過基因測序及RT-PCR篩選出兩組外泌體之間lncRNA FGD5-AS1的表達存在差異。根據上述結果，我們推測EPCs-Exo可能是通過其中富含的lncRNA FGD5-AS1來抑制紫杉醇誘導的內皮細胞焦亡，從而降低藥物涂層支架內ISR的發(fā)生率。