黃芩苷通過調控LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸治療低氧性肺動脈高壓

吳佩亮，陳馬云，王良興，黃曉穎

溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325015

肺動脈高壓（pulmonary hypertension, PH）是指肺動脈壓力異常升高導致的以不可逆右心室衰竭為特征的進行性疾病[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一類長度大于200 nt并且不編碼蛋白質的非編碼RNA[2]。一種新的LncRNA肺腺癌轉移相關轉錄物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）是一種真正的LncRNA，長度超過8 000 nt[3]，研究表明MALAT1可作為PH易感性的潛在指標[4]。miRNAs在轉錄后調控中起著至關重要的作用。據報道，miR-361-3p可調節癌細胞的增殖、遷移、侵襲和干細胞性[5-6]。轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）在調節細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡方面也發揮著重要的作用[7]。本課題組前期研究發現黃芩苷（Baicalin）能抑制慢性低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移，可能具有改善PH的作用。本研究通過建立低氧性肺動脈高壓（hypoxia induced pulmonary hypertension, HPH）模型和低氧肺動脈平滑肌細胞模型，探討黃芩苷是否通過LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β信號通路來調控PH的發生發展。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細胞 健康SPF級雄性C57BL/6小鼠18只，體質量20～25 g，購于浙江省醫學科學院，飼養在溫州醫科大學實驗動物中心，本研究通過動物實驗倫理學批準。小鼠肺動脈平滑肌細胞（murine pulmonary artery smooth muscle cells,MPASMCs）購自美國典型培養物保藏中心（美國ATCC），并在含有10%胎牛血清（美國Gibco公司）和1%青鏈霉素的DMEM培養基（美國Gibco公司）中培養。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組和造模：將18只C57BL/6小鼠按體質量隨機分成3組（每組6只）：常氧對照組（Normal）、慢性低氧性肺動脈高壓組（Hypoxia+Saline）、慢性低氧性肺動脈高壓+黃芩苷組（Hypoxia+Baicalin）。動物造模：將Normal組小鼠置于常壓常氧的SPF屏障中，Hypoxia+Saline組及Hypoxia+Baicalin組小鼠置于全自動常壓低氧大小鼠實驗艙內，在CO2、O2、濕度三合一監測儀的控制下，最終使得箱體內的O2濃度維持在10%±1%，CO2濃度維護在2%±1%，造模21 d；Hypoxia+Baicalin組小鼠每日入實驗艙前腹腔注射60 mg/kg Baicalin；每日密切關注C57BL/6小鼠活動情況、飲食情況、精神狀態。將MPASMCs按照實驗目的隨機分為：常氧對照組（Normal）、常氧+高劑量黃芩苷組（Normal+ 100 μmol/L Baicalin）、低氧組（Hypoxia）、低氧對照組（Hypoxia+Saline）、低氧+低劑量黃芩苷組（Hypoxia+50 μmol/L Baicalin）、低氧+高劑量黃芩苷組（Hypoxia+100 μmol/L Baicalin）。細胞造模：MPASMCs在低氧培養箱中培養，持續注入92% N2+5% CO2+3% O2，并在37 ℃下持續培養48 h。對于Normal組，將MPASMCs置于常氧培養箱中，持續注入74% N2+5% CO2+21% O2，并在37 ℃下持續培養48 h。

1.2.2 血流動力學指標測定：腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/20 g）麻醉C57BL/6小鼠，固定小鼠后分離右頸外靜脈，PE微導管插管至右心室，隨即用Powerlab生理信號記錄系統動態記錄小鼠右心室壓力（right ventricular systolic pressure, RVSP）。分離左頸總動脈，PE微導管插入小鼠左頸總動脈后記錄頸總動脈的壓力（mean carotid arterial pressure, mCAP）。

1.2.3 肺血管結構重塑指標及TGF-β、p-smad2、p-smad3測定：取小鼠右肺下葉放入4%多聚甲醛中固定48 h，肺組織常規石蠟包埋切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色及免疫組化染色。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析肺小動脈管壁直徑/管總直徑（wall thickness/total thickness, WT/TT）、肺小動脈管壁面積/管總面積（wall area/total area,WA/TA）、TGF-β、p-smad2、p-smad3的表達量。

1.2.4 細胞轉染：細胞轉染陰性對照（miR-NC）、miR-361-3p模擬物（miR-361-3p mimics）和miR-361-3p抑制劑（miR-361-3p inhibitor）購自廣州銳博生物公司。pcDNA3.1-MALAT1過表達載體（MALAT1 vector）、針對MALAT1的小干擾RNA（siRNA）和siRNA陰性對照（si-NC）購自上海吉瑪生物公司；轉染試劑使用Lipofectamine 3000（美國Invitrogen公司）。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）：使用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）分離出總RNA，使用高容cDNA反轉錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific, USA）進行cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（大連Takara公 司）進行PCR。使用GAPDH或U6對表達值進行標準化，并通過2-ΔΔCt方法進行量化。引物序列如下：TGF-β， F 5’-GGCCAGATCCTGTCCAAGC-3’、R 5’-GTGGGTTTCCAC CATTAGCAC-3’；MALAT1，F 5’-CAGCACATGACGGAGGTTG T-3’，R 5’-TCATCCAAATACTCCACACGC-3’；GAPDH，F 5’-AGTGGCAAAGTGGAGATT-3’，R 5’-GTGGAGTCATACTGGA ACA-3’；miR-361-3p，F 5’-CCCTCAGTGGCTCAGTAG-3’，R 5’-CCACCAGAGACCCAGTAG-3’；U6，F 5’-CTCGCTTCGG CAGCACA-3’，R 5’-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.6 細胞增殖實驗：應用細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）法檢測MPASMCs的活力。MPASMCs（每孔5 000個細胞）接種在96孔板過夜，然后與10 μL CCK-8溶液（美國Thermo Fisher Scientific公司）在37 ℃每孔4 h。最后，每個孔在450 nm處的吸光度通過分光光度計（美國Bio-Rad公司）檢測。

1.2.7 傷口愈合實驗測定：將MPASMCs置于6孔板上培養，待細胞生長匯合度達到80%時，用移液管在細胞中劃出一條垂直劃痕。用PBS去除細胞碎片后，將細胞培養在新鮮的無血清中培養基24 h。拍照測量MPASMCs的遷移距離以量化細胞遷移率。

1.2.8 蛋白質印跡（Western blot）分析 利用蛋白裂解液（上海碧云天公司）裂解細胞提取蛋白質，BCA法測定蛋白濃度，然后10% SDS PAGE電泳，轉膜，封閉。應用TGF-β、p-smad2、p-smad3，cyclin B1、PCNA、Ki-67、MMP2和MMP9（武漢三鷹公司）進行一抗孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min。室溫下加入熒光二抗抗體（美國Abcam公司）孵育 1.5 h，洗膜3次，每次10 min，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統選擇800通道進行掃描條帶，以GAPDH作為內參照標化。

1.2.9 熒光素酶報告基因檢測：TGF-β mRNA 3’UTR或MALAT1結合序列的突變體（mutant）或野生型（wild）被克隆到熒光素酶報告基因中，建成pmiR-RB-報告載體[Promega（北京）公司]。之后，MPASMCs被共轉染到使用miR-361-3p模擬物或miRNC模擬物和相應的熒光素酶報告基因。孵育48 h后，雙熒光素酶檢測試劑盒[Promega（北京）公司]用于分析熒光素酶活性。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0統計軟件進行處理。計量資料用±s表示，兩組間比較用t檢驗；多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對低氧誘導的MPASMCs增殖和遷移能力的影響 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs的增殖能力顯著增加（P＜0.05）；而經黃芩苷干預后，Hypoxia組MPASMCs增殖能力顯著下降，其中Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組較Hypoxia+ 50 μmol/L Baicalin組的抑制作用更明顯（P＜0.05），見圖1A、圖1B。與Hypoxia組比，Hypoxia+ 50 μmol/L Baicalin組和Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs細胞的遷移能力顯著下降，其中100 μmol/L Baicalin組較50 μmol/L Baicalin組抑制作用更為明顯（P＜0.05），見圖1C、圖1D。與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中增殖標志物cyclin B1、PCNA和Ki-67的蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），見圖1E。與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中細胞遷移標志物MMP2和MMP9的蛋白表達量顯著下降，見圖1F。

圖1 黃芩苷對低氧誘導的MPASMCs增殖和遷移能力的影響

2.2 黃芩苷對肺小動脈重構、RVSP、mCAP的影響 HE染色結果提示與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠肺組織中肺動脈中膜平滑肌細胞明顯增生，管腔明顯狹窄；Hypoxia+Baicalin組較Hypoxia+ Saline組肺動脈中膜平滑肌細胞增生減少，管腔狹窄減輕，見圖2A。與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠WA/TA、WT/TT和RVSP顯著升高（P＜0.01）；與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組WA/TA、WT/TT和RVSP顯著下降（P＜0.05），見圖2B、圖2C、圖2D。但Normal、Hypoxia+Saline、Hypoxia+Baicalin三組間mCAP差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2E。

圖2 黃芩苷對HPH模型小鼠肺病理組織學以及血流動力學的影響

2.3 黃芩苷抑制TGF-β信號通路激活 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達顯著下降（P＜0.05），見圖3A。與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組小鼠肺動脈內TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達表達顯著下降（P＜0.05），見圖3B。

圖3 黃芩苷對TGF-β信號通路的影響

2.4 黃芩苷調控LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸 基于GEO數據庫分析了COPD和健康對照人群中差異表達的miRNA（GSE38974），并利用在線預測工具（Starbase和miRanda）篩選出能夠靶向TGF-β的miRNA，對上述集合取交集后篩選出候選基因miR-361-3p，見圖4A、圖4B、圖4C。雙熒光素酶報告結果顯示，與mutant組比，wild組miR-361-3p熒光活性明顯減弱（P＜0.05），見圖4D。MPASMCs細胞過表達miR-361-3p后，TGF-β mRNA表達水平顯著下降；而沉默miR-361-3p后，TGF-β mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖4E。提示miR-361-3p能夠靶向抑制TGF-β表達。生物信息預測提示MALAT1能夠靶向吸附miR-361-3p，見圖4F。雙熒光素酶報告基因實驗和RT-qPCR實驗證實MALAT1能夠抑制MPASMCs中miR-361-3p的表達（P＜0.05），見圖4G、圖4H。與Normal組比，Normal+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中miR-361-3p和MALAT1表達水平無明顯變化，而Hypoxia組MPASMCs中miR-361-3p表達顯著下降，MALAT1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Hypoxia組比，Hypoxia+100 μmol/L Baicalin組MPASMCs中miR-361-3p表達顯著升高，MALAT1表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖4I、圖4J。與Normal組比，Hypoxia+Saline組小鼠肺組織中miR-361-3p顯著下降，MALAT1表達水平顯著升高（P＜0.05）；與Hypoxia+Saline組比，Hypoxia+Baicalin組小鼠肺組織中miR-361-3p顯著升高，MALAT1表達水平顯著下降（P＜0.05），見圖4K、圖4L。

圖4 黃芩苷對LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸的調控

2.5 LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸的體外Western blot鑒定 與Normal組比，Hypoxia組MPASMCs中TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；而對MALAT1進行干擾沉默后，TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達水平較Hypoxia組顯著下降（P＜0.05）；對miR-361-3p進行過表達后，TGF-β、p-smad2、p-smad3蛋白表達水平較Hypoxia組顯著下降（P＜0.05），見圖5。

圖5 LncRNA-MALAT1/miR-361-3p/TGF-β軸對TGF-β信號通路的影響

3 討論

PH的特征是肺動脈內皮細胞、平滑肌細胞的異常增殖，最終導致肺血管重構，從而使患者肺血管阻力增加，右心衰竭致死亡[8]。近年來PH的治療取得了一定進展，但肺移植依然是其最有效的治療選擇。目前臨床上已被批準用于治療PH的藥物主要針對以下三個關鍵途徑：內皮素途徑、前列環素途徑和一氧化氮/可溶性鳥苷酸環化酶途徑[9]。這些藥物可以降低肺動脈的張力，從而在一定程度上改善患者的癥狀，但不能預防或逆轉疾病的進展[10]。

HPH模型是目前公認的兼顧穩定性且重復率較高的PH建模方式[11]。本研究中，小鼠經低氧誘導后，肺組織及肺動脈壁產生明顯的病理變化，同時低氧組小鼠RVSP顯著增加，提示小鼠HPH建模成功。黃芩苷（7-葡萄糖醛酸，5，6-二羥基黃酮）是從黃芩中純化提取的類黃酮成分，目前已被廣泛用于治療各種疾病，如支氣管炎、腎炎、肝炎和哮喘[12-13]。 研究發現黃芩苷具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗氧化、抗血栓形成、抗腫瘤和抗增殖作用[14]。在心肌炎中，黃芩苷通過下調IL-6和TNF-α抑制脂多糖誘導的炎癥[15]；在口腔炎癥中，黃芩苷通過抑制TNF-α、IL-6和核因子-κB的表達發揮抗炎作用[16]。 本研究中細胞實驗結果顯示：黃芩苷可顯著抑制MPASMCs的增殖能力并且細胞增殖相關蛋白的表達水平也顯著下降；同時黃芩苷還能夠顯著抑制MPASMCs的遷移和侵襲能力。動物實驗結果表明黃芩苷能夠改善HPH的肺動脈病理學變化，進而減輕肺動脈結構重塑。以上體內外實驗結果提示黃芩苷能夠緩解HPH的發生發展。

研究發現，PH患者血漿中的TGF-β表達量高于正常健康人，PH患者平均肺動脈壓力的增高與TGF-β的血漿濃度水平成正相關[17]。另有研究表明，使用IN-1233可抑制TGF-β的表達，且能夠顯著抑制PASMCs的遷移作用，表明TGF-β信號通路可誘導平滑肌細胞遷移，進而參與了PH的發展進程[18]。非編碼RNA在體內表達豐富且靈敏高效，作為一類新的免疫調控因子參與了機體的固有免疫應答和對炎性反應的調控，一系列非編碼RNA已經被證實參與PH的發病過程，研究發現對炎癥相關的非編碼RNA進行靶向干預進而減輕炎癥反應可能是治療PH的有效手段[19]。本研究中我們利用生物信息學技術篩選并基于實驗證實了能夠靶向調控TGF-β的MALAT1/miR-361-3p/TGF-β信號調控軸。有研究發現miR-361-3p在PH患者中低表達，并且miR-361-3p能夠抑制PASMCs細胞的增殖，與本研究結果一致[20]。本研究表明MALAT1在低氧MPASMCs模型中顯著上調，并能夠通過靶向吸附miR-361-3p促進TGF-β的表達。另有報道同樣也證實MALAT1能夠促進PASMCs的增殖和遷移并抑制其凋亡[21]。

綜上所述，本研究結果證實黃芩苷能夠減輕HPH小鼠的肺動脈壓力，改善肺血管重塑，抑制低氧誘導的PASMCs異常增殖。進一步探究其作用機制發現黃芩苷能夠抑制LncRNA-MALAT1的表達水平，繼而通過ceRNA機制吸附miR-361-3p抑制TGF-β的表達，最終達到抑制HPH的發生發展。