皮膚鱗狀細胞癌各種發病信號通路的研究進展

郝高媛 王凌 趙伊珂 邱其其 王博 肖凡雅 趙才郡 李艷玲

鱗狀細胞癌由皮膚表皮發展而來，表皮是保護人體的一種重要的免疫屏障，主要由排列成多層的角質形成細胞組成。基底膜帶是由細胞外蛋白組成的一種機械屏障，分隔皮膚的表皮和真皮成分。角質形成細胞的增殖被限制在基底層，而基底層錨定在基底膜帶上，在分化過程中，角質形成細胞遷移到上層(棘層、顆粒層和角化層)，隨后退出細胞周期，依次激活相關的基因，從而產生有助于屏障功能的蛋白質和脂質[1]。角化形成細胞增殖和分化的失調是cSCC發生、發展的基礎。已有多條分子通路參與了cSCC的發生發展。細胞的生長、運動和存活受到體內穩態環境所發信號的嚴格控制。這些信號由細胞表面受體接收，并由不同的信號通路處理，以觸發特定的細胞反應。已經在不同的通路成分中發現了一些突變，超出信號調節的限制導致細胞不受控制的生長。失調的信號通路在皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC)的發病機制中起著非常重要的作用，關于cSCC發病機制中各種通路的深入研究有助于確定新的藥物靶點和開發有效的治療方法。本文將對皮膚鱗狀細胞癌中涉及的各種信號通路展開詳細的闡述。

1 CSCC概述

cSCC是一種侵襲性的非黑色素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancer，NMSC)，是全球第二位常見的皮膚癌癥，其發病率不斷增加。cSCC占皮膚惡性腫瘤的20%，占皮膚癌(不包括黑色素瘤)死亡總數的75%左右[2]。在我國，患cSCC的≥60歲人群約有29.7萬人，中位發病年齡為57歲，男女比約2.08∶1。cSCC的病因是多因素的，包括環境、免疫和遺傳因素。絕大多數的流行病學和實驗研究都認為累積暴露于紫外線(UV)輻射是cSCC發病的主要環境危險因素[3]。紫外線輻射的三種亞型(A、B、C，以波長區分)只有UV-A和UV-B被認為與皮膚癌的發病機制相關。雖然UV-B的每日劑量比UV-A要低得多，然而，UV-B卻更加危險，因為它可以被細胞核DNA和表皮中的蛋白質強烈吸收，從而對表皮角質形成細胞產生影響。在紫外線照射的刺激下，表皮基底層的黑素細胞通過產生黑素來吸收紫外線，因此，膚色較深的個體患皮膚癌的幾率要低得多，因為他們具有較高水平的光保護色素。然而，如果反復暴露在強烈的紫外線輻射下，這種保護很容易失效，接下來會出現皮膚損傷。與間歇性和強烈的日曬常增加基底細胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的風險相對比，cSCC的風險主要與累積的日曬量有關。除紫外線輻射外，遺傳性疾病(著色性干皮病、白化病、大皰性表皮松解癥等)、人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染、嚴重砷暴露、慢性免疫抑制狀態(器官移植)被認為是cSCC發生的易感因素[4,5]。

cSCC可以是原發的，但大多數cSCC繼發于光化性角化病(actinic keratosis，AK)和鮑溫病(Bowen’s disease，BD)等癌前病變。在免疫功能低下的患者中，單個AK及單個BD進展為cSCC的風險分別為20%或16.3%，病變生長和出血提示可能會發展為cSCC。盡管cSCC很少發生轉移，但可導致局部皮膚破壞，并累及軟組織、軟骨和骨骼。cSCC預后一般較好，5年生存率≥90%[6]。皮膚鏡檢查和反射式共聚焦顯微鏡提高了 cSCC 的診斷準確性。外科手術是目前治療cSCC的一線方法，除此以外還有刮除術、冷凍療法、激光和光動力療法等無創療法，對于晚期發生轉移、不適合手術的患者，放射治療(radiation therapy，RT)被認為是主要的治療方法[7]。

2 cSCC與各種信號通路

2.1 表皮生長因子受體通路 表皮生長因子受體(epithelial growth factorreceptor ，EGFR)通路在調節細胞生長和存活中起著至關重要的作用。在人類基因組中共有4個基因編碼EGFR，但只有3個基因在正常角質形成細胞中表達，它們分別是EGFR (ERBB1)、HER2 (ERBB2)和HER3 (ERBB3)[8]。當配體與EGFR結合后，EGFR便被激活，相鄰受體會迅速匯聚成二聚體，從而發揮酪氨酸激酶的作用，觸發下游激酶級聯反應。紫外線輻射可以激活EGFR，導致細胞周期蛋白D的激活和p53的抑制，從而誘導表皮增生[9]。因此，紫外線誘導的EGFR激活是表皮組織的一個特征。抑制EGFR可以減少紫外線導致的紅斑、增生、淋巴細胞浸潤及細胞因子的產生。

EGFR拷貝數的增加不僅在cSCC中頻繁出現，并且也會發生于AK中，這表明該通路在cSCC癌變早期發生了改變。免疫組化(IHC)顯示在鱗狀細胞癌中存在EGFR的過度表達以及胞漿的異常染色。EGFR的過度表達可以預測疾病進展，也有研究發現在轉移性腫瘤中EGFR的過度表達比原發性腫瘤更為常見[10]。鑒于 EGFR 在 cSCC 中的頻繁改變及其在癌癥進展中的關鍵作用，其代表了一個有吸引力的治療靶點，抗體和小分子抑制劑目前均在研發。西妥昔單抗是一種針對表皮生長因子受體的單克隆抗體，于 2006 年被批準用于治療晚期頭頸部 cSCC。西妥昔單抗單獨使用或與其他療法一起聯用于不可切除的cSCC以及轉移性 cSCC 的總體緩解率約為 50%，并且其在老年患者中的應用也十分安全[11]。

2.2 MAPK通路 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路有三級的信號傳遞過程：MAPK，MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)。這3種激酶能依次激活，共同調節著細胞的生長、分化、應激、炎性反應等多種重要的生理/病理效應[12]。RAS-RAF-MEK-ERK信號通路是MAPK通路中的一種，該通路在皮膚非黑色素瘤皮膚癌的發病機制中起著至關重要的作用。關鍵的活化步驟是生長因子與酪氨酸激酶細胞表面受體結合，隨后消化GTP激活RAS蛋白。激活的GTP-RAS復合物促進RAF二聚體的形成，RAF二聚體通過磷酸化激活MEK-ERK級聯反應。ERK與多種胞漿靶點和核底物(包括激酶、細胞骨架蛋白和轉錄因子)相互作用，從而啟動細胞增殖、分化、存活、遷移、血管生成和染色質重構[13]。

RAS存在有3種旁系同源基因：H-RAS、K-RAS和N-RAS，這些同源基因在表皮發育過程中是非常必要的[14]。若表皮組織中3個RAS同源基因的同時缺失，則會抑制細胞的增殖與分化，導致出生后死亡。在cSCC中，與其發病有關的基因為H-RAS，據報道，在20%～30%的cSCC中存在H-RAS突變，而在10%的原發性cSCC和10%的轉移性cSCC中存在H-RAS缺失[14]。在經典DMBA(7,12-二甲基苯并[a]蒽)加TPA (12-O-十四烷酰波醇-13-乙酸酯)小鼠cSCC模型中，誘變劑DMBA可以促進95%的腫瘤發生H-RAS突變，而重復應用TPA則促進增殖，導致其增生[14]。H-RAS突變在不同的年齡階段發生的表現不同， H-RAS突變在年輕小鼠發生表現為輕度異型增生，而在老年小鼠中則發展為更嚴重的異型增生，表現為伴有增生、炎癥以及巨噬細胞和T細胞的明顯浸潤，最終發展為cSCC。

RAF蛋白是由RAS直接激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶，人類基因組編碼了3個RAF基因:a-RAF、b-RAF和c-RAF，b-RAF突變在黑色素瘤中非常普遍，但在cSCC中很少見[15]。MAPK激酶(MEK)分為MEK1和MEK2，位于RAF的下游，兩種激酶對于表皮發育是不可或缺的，他們的同時缺失會導致嚴重的增殖缺陷以及出生后的迅速死亡。激活的RAF蛋白可以進一步刺激MEK1或MEK2，最終導致表皮角質形成細胞的增生。據相關報道，MEK抑制劑能在體外引起cSCC細胞衰老，并在cSCC小鼠模型中阻止腫瘤的發展[16,17]。MEK抑制劑可能是一種有價值的治療cSCC的藥物。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)，包括ERK1和ERK2，參與ETS-1轉錄活性的調節，這是將信號從表面受體傳導至細胞核的關鍵。ETS-1屬于ETS轉錄因子家族，其特征是存在一個保守的ETS DNA結合域。ETS-1控制許多靶基因的轉錄，包括對細胞外基質重塑和對血管生成至關重要的金屬蛋白酶家族成員，以及參與細胞增殖和存活的基因(bcl-2、caspase-1、p16、p21、p53)[18]。因此，ETS1是癌細胞發育和腫瘤進展的重要介質。另外，與原位和高分化cSCC相比，ETS-1在低分化和轉移性cSCC中表達水平更高，且ETS-1上調與NMSC中的腫瘤局部復發相關。

2.3 端粒酶通路 端粒酶(Telomerase)是一種核糖核蛋白復合體，通過在染色體3’端合成端粒DNA重復序列(TTAGGG)來維持端粒長度，從而逆轉細胞分裂過程中端粒DNA的進行性縮短，賦予細胞復制的永生性[19]。端粒和端粒酶功能受損會導致腫瘤的發生和發展，端粒酶由hTERT基因編碼的逆轉錄酶(TERT)蛋白和作為端粒DNA合成模板的RNA(HTERC)組成。研究表明，啟動子突變導致了hTERT基因的激活，為ETS轉錄因子家族創造了新的結合位點，從而促進端粒酶的表達，導致了癌細胞的發生及發展[20]。最近在31.6%的cSCC中發現了TERT啟動子突變，大部分與癌癥的復發和轉移有關，但TERT啟動子突變在cSCC中有關預后的作用尚需進一步研究[19]。

2.4 Notch通路 Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，在進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調節細胞、組織、器官的分化和發育。最近的科學發現表明，Notch通路在表皮分化和增殖過程中起著重要的調控作用。Notch受體和相應的配體存在于皮膚中，直到今天它們的大部分特殊功能仍不確定[21]。已有研究表明，Notch受體和配體在表皮不同細胞層中的表達具有差異性[22]。在正常成人表皮中的角質形成細胞中可以觀察到Notch信號的增加。相反，在尋常型銀屑病和其他增生性皮膚病中Notch信號通路的活性被描述為降低[22]。人類基因組編碼了四種膜結合Notch受體，但只有Notch1、2和3在角質形成細胞中表達。Notch在cSCC中發生突變的頻率分別為：Notch1 42.6%～75%， Notch2 18%～59%， Notch3 7.4%；研究表明Notch1的缺失可誘導表皮增生，破壞分化，并在化學誘導下促進腫瘤形成[23]。

腫瘤抑制因子p53 (TP53)及其家族成員p63 (TP63)和p73 (TP73)各自的功能及其在皮膚鱗狀細胞癌發病過程中的相互作用已被廣泛研究。p53有能力阻止基因組發生突變，因此它通常被稱為“基因組的守護者”。p53蛋白包含以下結構域:反式激活結構域(trans-activation domain，TA)、DNA結合結構域(DNA binding domain，DBD)和寡聚結構域(oligomeric domain，OD)。由于p53在維持基因組穩定性中起著至關重要的作用，它的失活在癌癥中非常常見。在人類腫瘤中觀察到的大多數p53突變屬于DBD的突變。在角質形成細胞中，p53通過誘導Notch1等靶基因的表達來發揮其腫瘤抑制功能[24]。p53家族成員和Notch信號通路之間存在交叉調控。目前認為，更好地了解Notch、p53和細胞衰老之間的相互作用，可以使我們開發出有前景的新療法來治療皮膚癌癥。

2.5 PRB通路 RB基因是一種腫瘤抑制基因，它是世界上第一個被克隆和完成全序列測定的抑癌基因，RB蛋白分布于核內，是一類DNA結合蛋白。在細胞周期的G1期，Rb蛋白被細胞周期蛋白-細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-CDKs)磷酸化后變成PRB，PRB能和與DNA復制有關的E2F轉錄因子結合，使E2F轉錄因子失去活性[25]。據報道，8%的AK和16%的cSCC病例中存在RB蛋白表達缺失；細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的過度表達似乎是cSCC癌變的早期事件，因為它也在AKs中被發現[26]，具體來說，Cyclin D1在43%～46%的BD和AKs以及60%～71%的cSCC病例中過度表達。據報道，Cyclin D1的過度表達與腫瘤的浸潤深度和轉移率正相關[27]。然而，Cyclin D1過度表達和cSCC分化程度之間并沒有相關性。總的來說，需要更大規模的研究來證實Cyclin D1是否可以作為判斷cSCC預后的生物標志物。

2.6 CDKA2N通路 CDKN2A基因也稱多重腫瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，到目前為止，CDKN2A被發現與皮膚惡性腫瘤的發生高度相關。CDKN2A作為腫瘤抑制基因，負調控細胞周期進程，促進細胞衰老。最近，在皮膚惡性腫瘤中發現了反復出現的CDKN2A突變，CDKN2A位點的失活可能是由雜合性丟失、點突變和啟動子超甲基化所致，而CDKN2A位點的失活會導致細胞周期和細胞生長的失控[28]。目前已在21%～62%的cSCC中發現了雜合性丟失或點突變，在35%～78%的病例中發現了啟動子超甲基化。CDKN2A位點基因位于9號染色體，該基因包含2個內含子和3個外顯子，編碼2種選擇性剪接蛋白：p16INK4a和p14ARF，分別通過PRB通路和p53通路抑制細胞周期的進展和增殖[29]。p16INK4a蛋白是一種核磷蛋白，由156個氨基酸組成，分子量為16 kDa，它被認為是一種腫瘤抑制基因，是細胞周期的負調節因子。因為它直接與CDKs結合，抑制其激酶活性，阻止PRB磷酸化和E2F-靶基因介導的轉錄，從而導致細胞周期的阻滯和細胞的衰老。p16INK4a 的丟失在各種腫瘤的發展過程中越來越普遍，這表明 p16INK4a的失活可能導致癌癥的發生、發展[30, 31]。P14ARF是一種腫瘤抑制因子，能抑制HDM2形成穩定的復合體，HDM2的功能是結合p53并促進其降解。因此，p14ARF與HDM2拮抗，維持p53的轉錄活性導致細胞周期停滯或凋亡。

2.7 轉化生長因子β通路 轉化生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)信號通路是由35個TGF-β配體、13個受體和8個SMAD蛋白組成[32]。TGF-β受體突變在 cSCC 中很常見，其在鱗狀細胞癌中發揮著促進腫瘤異質性和耐藥性的作用。隨著cSCC的進展，TGF-β信號的作用也在發生著變化。在早期腫瘤的發生過程中，TGF-β信號通常通過抑制角質形成細胞的增殖而發揮抑制作用，但隨著鱗狀細胞癌的進展而轉變為促進細胞增殖的作用[33]。最近評估TGF-β阻斷抗體安全性的臨床試驗證實了TGF-β信號在cSCC中的腫瘤抑制作用，雖然在大多數cSCC中，它是一種有效的腫瘤抑制因子，但在晚期cSCC中，它可能在表觀遺傳的控制下轉換為一種有效的腫瘤促進因子。

TGF-β配體通過激活TGFBR1和TGFBR2的受體復合物來啟動信號傳導，然后使SMADs 2和SMADs3發生磷酸化。在cSCC中，TGFBR1和TGFBR2會發生反復的突變，主要導致SMAD信號的功能喪失。一些研究表明SMADs對cSCC有抑制作用[34]。例如，使用免疫組化檢測cSCC腫瘤樣本，我們可以發現在cSCC中SMAD2和SMAD3的減少與發生體積巨大、侵潤更深的腫瘤相關。表皮中SMAD4基因的突變可在一年內誘導70%～100%小鼠的形成cSCC。同樣，在化學物質致癌的誘導環境下，SMAD2的突變也會促進cSCC的形成。過度表達抑制性SMAD7的小鼠對化學致癌物的敏感性既不高也不低[35]。除了調節增殖外，轉化生長因子β信號還可以作為一種強大的單核細胞趨化劑。總的來說，各個成分的之間的相互矛盾使得應用抑制TGF-β途徑的藥物來治療鱗狀細胞癌充滿了挑戰。

2.8 PI3K/AKT/mTOR 通路 PI3K/AKT/mTOR 通路是 RTKs 和 RAS 下游的生存信號通路。一旦此通路被激活，脂質激酶 PI3K 則將質膜 PIP2 轉化為質膜 PIP3，導致絲氨酸/蘇氨酸激酶 AKT 的激活，進而激活 mTOR ，mTOR 通過誘導 RNA 翻譯和蛋白質合成來調節細胞生長[36]。這種信號級聯受到蛋白酪氨酸磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)的負調節，PTEN可將PIP3去磷酸化為PIP2。在小鼠模型中，編碼 PI3K 催化亞基的 PIK3CA 基因的會發生突變或擴增，接著導致PTEN 功能喪失，進而激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，促進 cSCC 的發生和進展。目前已在7%～25%的 cSCC 中發現了 PTEN 基因改變，包括失活突變和純合子功能喪失[37]。在10% 的 cSCC 中發現了 PIK3CA 的突變[37]。

2.9 核轉錄因子κB 通路 核轉錄因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)信號通路在cSCC中表達上調，其具有促腫瘤以及抑制腫瘤的作用。NF-κB是維持表皮動態平衡的主要調節因子，有多個家族成員(RelA/p65、p50、p52、RelB和cRel)以及包括IkBα蛋白在內的許多上游調節因子，其作用高度依賴于細胞環境[38]。NF-κB在cSCC中的作用存在爭議，一些研究表明具有促癌作用，其他研究表明在腫瘤預防中發揮作用[38]。角質形成細胞的抑制和激活都可以促進表皮炎癥，增強的NF-κB活性似乎增加了小鼠對化學致癌物品的易感性。在人cSCC中，全基因組表達研究表明由NF-κB控制的基因在cSCC和AK中均表達上調。此外，炎癥性皮膚病的特征是高水平的活性、磷酸化的 NF-κB[39]。因此也可以推測NF-κB 是參與皮膚癌發病機制的關鍵介質。胱冬肽酶募集結構域(caspase recruitment domain 11, CARD11)是NF-κB信號通路上游的重要蛋白分子，對于NF-κB信號的轉導的起著關鍵的調節。研究表明，信號通路成員CARD11在cSCC中也存在大量突變[40]。CARD11的突變會導致NF-κB信號通路的持續激活，進而導致細胞無限增殖，參與腫瘤的發生、發展。

細胞的生長、運動受到體內環境信號的嚴格控制。這些信號由細胞表面受體接收，并由不同的信號通路來處理，以觸發特定的細胞反應。不同的通路下發生的突變會使細胞不受信號調節的限制，從而導致無止境的生長。cSCC是由角質形成細胞發展而來，角質形成細胞積累了大量的突變負荷，影響了基因表達和信號通路的調節。這種突變負擔促進了癌基因之間的協同作用，從而加速了cSCC的發展。盡管近年來在了解皮膚鱗狀細胞癌變的分子和遺傳基礎方面取得了重大進展，但仍然有許多不確定的地方。基因組和表觀基因組的改變強調了與cSCC相關的高突變負擔、多種信號通路失調和腫瘤異質性等特點，這表明了我們在靶向治療cSCC以及預測cSCC生物標志物方面仍然具有嚴峻的挑戰。闡明這類癌癥的發病機制和演變中所涉及的各種分子信號通路是目前主要的研究目標，因為它可以確定新的治療靶點，有助于對患者的診斷和治療。