丙泊酚通過上調microRNA let-7i的表達誘導上皮性卵巢癌細胞凋亡的機制

尹艷超 李江偉 李蕊 劉斌 張晉

卵巢癌有三種主要類型：上皮細胞，間質細胞和生殖細胞[1]；其中，上皮性卵巢癌(EOC)由卵巢表面上皮細胞構成，約占卵巢癌發病率的90%[2]。EOC是最常見的癌癥之一，也是世界上致癌性惡性腫瘤死亡的主要原因。大多數患者接受的治療包括手術、放療和化療，但整體來說，近5年患者的生存率較低[3]。微小RNA(miRNA)(20～24個核苷酸)轉錄后非編碼RNA基因產物通過負調節其靶信息的穩定性或翻譯效率來調節基因表達RNAs(mRNAs)[4]。當發現miRNA基因時，人們首次發現它可以調節白血病。隨后的報告已經表明：miRNA在mRNA中差異表達許多癌癥。miRNA現在被廣泛認為在許多惡性腫瘤中扮演重要角色，充當其中任何一種腫瘤抑制因子或癌基因[5,6]。有研究分析了miRNA可能有助于EOC的啟動和發展。據報道，microRNA let-7i經常參與EOC的調節[5]。研究者還發現一類micro RNA廣泛存在于生物體中，它通過結合目標mRNA，轉錄后抑制相關蛋白的合成，參與表達[7]。在某些條件下，miR從細胞中通過微泡釋放出來，核糖核蛋白轉運復合物和脂蛋白在循環中非常穩定。研究表明，let-7i表達降低可顯著增加卵巢癌細胞和對化療藥物順泊的耐藥性[8]。此外，let-7i表達減少與EOC患者的生存率低具有顯著相關性[7]。本文中，我們通過miR介導的調控機制，研究上皮性卵巢癌增殖并誘導細胞凋亡，即通過競爭RNA靶標，研究miRNA串聯或互補miR鏈對miR-let-7i調節的抗腫瘤作用。丙泊酚是廣泛和常用的靜脈麻醉藥之一。有更多證據表明丙泊酚具有在體外和體內影響癌細胞運動、增殖和侵襲性的能力[9]。但是，沒有關于抗腫瘤的可用信息證明丙泊酚在EOC細胞中的作用[10]。 目前的研究目標是評估丙泊酚影響人類EOC細胞和microRNA let-7i在這些細胞中的作用效果，報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與試劑 人EOC細胞(OVCAR-3)購于中國科學院上海細胞生物學研究所。細胞在RPMI 1640中培養，后置于10%胎牛血清和100 U/ml青霉素和鏈霉素的5%CO2培養基中37℃進行培養。丙泊酚在二甲基亞砜中稀釋用于體外測定。

1.2 培養基制備 添加2.5%胎牛血清、20%小牛血清和2.5%胎牛血清、20%小牛血清及BDNF(50 ng/ml、75 ng/ml 和100 ng/ml)以鼠尾膠原包被的 100 mm培養皿和孔板，在超凈臺內過夜，涼干備用。

1.3 細胞培養與分組 取OVCAR-3細胞：加80% DMEM液、10%胎牛血清、2 mg/L兩性霉素B、10%小牛血清、100 U/ml青霉素、15 mmol/L Hepes及100 mg/L鏈霉素, pH值中性，計數后調整培養基量，使其細胞數達到1×105個/ml。置于5% CO2培養箱內37℃下培養2～3 d后更換一次培養液，每48～60小時傳一代細胞，待細胞形成單層細胞后傳代或在6孔板上接種，保持細胞的良好狀態以備實驗。待6孔板上細胞密度到80%時，加入含2.5%胎牛血清、20%小牛血清和BDNF(50 ng/ml、75 ng/ml和100 ng/ml)培養液，取分化后第3天的細胞用于實驗。實驗分組：(1)空白對照組；(2)卵巢癌細胞損傷組；(3)丙泊酚處理組；每組設置8個復孔。

1.4 Transwell法檢測細胞數

1.4.1 將培養好的細胞去除血清，Matrigel過夜鋪膠，4℃過夜存放。Transwell上室加入稀釋后的Matrigel，37℃孵育2 h聚合成膠。胰酶消化，細胞計數，調整細胞密度至1×105/ml，取100 μ1加入到Transwel小室，500 μl完全培養基加入到Transwel下室，最后至于37℃，5%的CO2培養箱中培養2 d。

1.4.2 OVCAR-3細胞染色：用甲醛固定細胞20 min后，加入0.5%的結晶紫溶液作用15 min，顯微鏡拍照，計數，觀察細胞數。

1.5 細胞生長和活力測定 將細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中，培養皿中加入最終體積為180 μl的培養液在37℃、5%的二氧化碳培養箱中培養。在不同時間溫育后，向每孔中加入20 μl的5 mg/ml MTT，之前使用1×PBS進行潤洗。然后在37℃下孵育4 h。將樣品溶于DMSO中，20 μl/孔中，并搖動15 min。在多重檢測微板讀數器上，570 nm的波長下測量每個孔的吸光度。

1.6 細胞凋亡檢測 用丙泊酚處理細胞24 h后，收獲細胞，洗滌，重懸于染色緩沖液中，并用試劑盒進行檢測。通過FACSCalibur檢測細胞染色情況，用CellQuest軟件對數據進行分析。利用Annexin V和碘化丙啶(PI)檢測細胞凋亡情況。

1.7 MicroRNA的提取和純化 在沒有(對照)或處理的情況下用丙泊酚處理約5×106個細胞，作用24 h。使用trizol試劑分離并純化miRNA。miR-let-7i水平的測定通過實時熒光定量PCR，并用U6小核RNA作為內部歸一化進行參考。RT-PCR是在實時定量系統中上進行，擴增條件為：95℃預變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火/延伸1 min，進行40個循環；融解曲線分析為：94℃條件下進行15 s，60℃進行1 min、94℃進行15 s、60℃進行15 s，反應體系使用：Forward Primer(5 μmol/L)1 μl，Reverse Primer(5 μmol/L)1 μl，2×Gold Star Best Master Mix 10 μl，Template DNA 1 μl，RNase-Free Water 7 μl。見表1。

表1 RT-PCR引物序列設計

1.8 抗miR-let-7i轉染 用100 nmol/L的抗miR-let-7i轉染OVCAR-3細胞或使用siPort Neo-FX進行陰性對照。轉染24 h后，丙泊酚處理組用丙泊酚處理細胞，其余不做任何處理。

2 結果

2.1 3組細胞中細胞數比較 與空白對照組相比，卵巢癌細胞損傷組細胞侵襲能力顯著提高(P<0.05);與卵巢癌細胞損傷組比較，丙泊酚處理組細胞侵襲能力顯著減弱，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 3組細胞中細胞數比較

圖1 OVCAR-3細胞染色(×100)情況

2.2 異丙酚對細胞增殖和凋亡的影響

2.2.1 丙泊酚對細胞增殖和凋亡的影響:OVCAR-3細胞系在不同濃度培養基中，加入丙泊酚后細胞增殖以MTT分析，丙泊酚以劑量和時間依賴性方式抑制OVCAR-3。丙泊酚濃度為20 μmol/L和40 μmol/L分別在48和72 h時抑制增殖(P<0.05)。見表3。

表3 異丙酚對細胞增殖和凋亡的影響

2.2.2 annexin V/PI分析：丙泊酚暴露24 h后，細胞凋亡分析也顯示當濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時，丙泊酚顯著刺激細胞凋亡(P<0.05)。見表4。

表4 細胞凋亡的測定

2.3 異丙酚刺激 miR-let-7i的表達 與空白對照組比較，卵巢癌細胞損傷組和丙泊酚處理組細胞表達降低，隨著丙泊酚的加入，丙泊酚處理組表達顯著提升(P<0.05)，驗證丙泊酚治療效果顯著上調miR-let-7i在OVCAR-3細胞中的表達呈劑量依賴性方式(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 異丙酚對OVCAR-3細胞基因的相對表達量

圖2 OVCAR-3細胞基因表達情況

3 討論

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，是造成女性癌癥死亡的主要原因，主要是由于缺乏早期快速發現癌癥的方法。現如今，雖然卵巢癌的診斷和治療已取得很大的進展，但目前仍有許多尚未開發的領域，并且患者轉移或復發性疾病的預后仍然不佳[11]。本研究表明異丙酚抑制了OVCAR-3細胞增殖和誘導細胞凋亡;異丙酚可以刺激miR-let-7i的表達，對OVCAR-3生長和作用的影響通過抗miR-let-7i轉染逆轉細胞凋亡。

異丙酚是最常用的靜脈麻醉劑之一，具有順滑和麻醉誘導和快速恢復的作用，除了鎮靜/催眠特性外，異丙酚具有神經保護的作用。它對神經細胞凋亡產生顯著影響。異丙酚可通過不同的信號傳導途徑影響人類癌細胞侵襲的能力。異丙酚治療顯著降低了MMPs的表達，從而抑制了結腸癌的細胞侵襲活性[12]。異丙酚可有效抑制肝細胞生長，誘導肝癌細胞凋亡和miR-199a的調節可能有助于丙泊酚的抗腫瘤作用。臨床相關實驗證明，異丙酚濃度在(5.6～28 μmol/L)時顯著降低了人癌細胞(HeLa、HT1080、HOS和RPMI-7951)的侵襲能力[13]。本研究中，在卵巢癌中，異丙酚通過人上皮性卵巢癌細胞OVCAR-3中的miR-let-7i表達抑制細胞增殖和表達。因此，異丙酚在癌癥手術的圍手術期中使用可能是特別合適的麻醉劑。

微小RNA(miRNA)參與了大多數生物過程，包括細胞周期調節，細胞生長，細胞凋亡，細胞分化等。更確切地說，miRNA可以調節致癌或腫瘤抑制途徑[14]。miRNA廣泛參與人體生長、分化、免疫應答及炎性反應等生理過程，是調控其他功能基因表達的重要物質，在生物體的生長發育過程中具有重要作用。

理解人體內的miRNA活性可以為人類治療惡性腫瘤帶來新療法。microRNAs控制組織穩態和疾病的關鍵作用已得到廣泛認可。通過控制其目標的表達水平，從而抑制腫瘤的發展和進展[15]。作為最早的腫瘤抑制之一，miR-let-7家族已被證實在各種類型的腫瘤中具有上調作用[16]，對于miR-let-7i，在EOC中與順泊的化療敏感性和患者的生存相關。本研究發現異丙酚可以刺激miR-let-7在OVCAR-3細胞中的表達，抑制侵襲并促進細胞凋亡。與卵巢癌細胞損傷組細胞相比，丙泊酚侵染后，侵襲能力減弱；丙泊酚以劑量和時間依賴性方式抑制OVCAR-3細胞的增殖。細胞給藥接觸丙泊酚24 h后，OVCAR-3顯示細胞凋亡，在丙泊酚濃度為20 μmol/L和40 μmol/L分別在48和72 h時顯著抑制增殖；與空白對照組相比，卵巢癌細胞損傷組和丙泊酚處理組細胞中miR-let-7i基因表達顯著上調，且丙泊酚處理組細胞中miR-let-7i在EOC中表達上調明顯，miR-let-7i的表達增加，其呈現劑量依賴性方式；同時，丙泊酚可降低OVCAR-3中的蛋白表達。此外，抗miR-let-7i逆轉異丙酚對細胞增殖和凋亡會影響OVCAR-3細胞，表明異丙酚通過調節miR-let-7i起作用。

綜上所述，臨床相關濃度的異丙酚抑制增殖并誘導EOC細胞凋亡和miR-let-7i的調節可能有助于其抗腫瘤作用。