miR-301a靶向雌激素受體信號通路對乳腺癌細胞侵襲及上皮-間質轉化的影響

沈娜

乳腺癌是全世界女性中最普遍的癌癥類型，其發病率和死亡率較高，嚴重危害女性生命健康[1]。75%的乳腺癌是雌激素依賴型腫瘤，雌激素信號傳導通路在乳腺癌的發生、發展過程中起主要作用[2]。雌激素受體α(estrogen receptor-α，ERα)調節參與調節癌細胞的增殖、侵襲和遷移，在乳腺生物學和發育中起關鍵作用[3]，ERα及其相關信號通路介導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)影響乳腺癌細胞的侵襲過程[4]。目前研究發現miR-301a是一種致癌性miRNA，與結直腸癌和乳腺癌等多種癌癥的進展和不良預后有關[5]，但miR-301a對雌激素依賴性乳腺癌雌激素受體ERα調控作用研究筆者所見較少。本研究采用雙熒光素酶報告試驗驗證miR-301a與ERα的靶向關系，探討二者在乳腺癌細胞侵襲及EMT中的調控機制，為治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：人乳腺癌細胞MCF7(HZ-CC100452)購自上海滬震實業有限公司。

1.2 細胞培養及實驗設計分組

1.2.1 細胞培養：將MCF7細胞從液氮罐中取出，解凍并離心收集細胞，用含10%胎牛血清(美國Hyclone公司)的DMEM培養基(美國Hyclone公司)懸浮細胞并接種于細胞皿中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，細胞密度達80%時，對細胞進行傳代、計數。

1.2.2 試驗設計及分組：收集對數生長期、生長狀態好的MCF7細胞，分為control組(不做任何處理，正常培養)、miR-301a mimics組[轉染miR-301a激動劑(miR-301a mimics，貨號：CMH0147，購自廣州威佳科技有限公司)]、miR-301a inhibitiors組[轉染miR-301a抑制劑(miR-301a inhibitiors，貨號：hsa-mir-301a-3p，購自江蘇百奧邁科生物技術有限公司)]、miR-301a MNC組[轉染miR-301a激動劑陰性對照試劑(miR-301a MNC)]、miR-301a INC組[轉染miR-301a抑制劑陰性對照試劑(miR-301a INC)]。5組均以2×105/孔接種于6孔板上，各轉染試劑均按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行轉染，轉染后48 h收集細胞供后續使用。5組均設置6個復孔，試驗重復6次。

1.3 方法

1.3.1 Transwell檢測MCF7細胞侵襲情況：將基質膠(美國BD公司)與不含血清的DMEM培養基按1∶8的比例混合稀釋后包被在上層小室并風干過夜，在上室中接種1.2.2中5組重懸細胞(細胞密度2×106/ml)，下室加入600 μl DMEM培養基(含10% FBS)。培養24 h后去除小室，棉簽擦除上室基質膠與細胞，甲醛固定15 min后0.1%結晶紫染色，用IX53倒置顯微鏡(Olympus Corporation)隨機選取5個視野并拍照，取平均值。5組均設置6個復孔，試驗重復6次。

1.3.2 雙熒光素酶報告：合成ERα的3’非翻譯區(3’UTR)的miR-301a識別序列，克隆至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-ERα 3’UTR-WT。另外對miR-301a識別區ERα堿基進行突變連接至pmiRGlo載體，得到pmiRGlo-ERα 3’UTR-MUT，分別將pmiRGlo-ERα-3’UTR-WT、pmiRGlo-ERα-3’UTR-MUT質粒與miR-301a NC、miR-301a mimics共轉染，24 h后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書添加螢火蟲和海參熒光素酶試劑上機檢測。每孔的數值以螢火蟲熒光活性/海參熒光活性顯示，試驗重復6次。

1.3.3 熒光實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測miR-301a、ERα mRNA表達情況：收集1.2.2中5組細胞，利用Trizol試劑盒(貨號：15596026，購自賽默飛世爾中國公司)抽提細胞總RNA，應用反轉錄試劑盒(貨號：4366597，購自賽默飛世爾中國公司)將1 μg RNA反轉錄為cDNA。用反轉錄混合液(5x HOT FIREpol Eva Green qRT-PCR，貨號：08-33-00001，購自愛沙尼亞Solis Biodyne)進行qRT-PCR。反應體系為：將2.5 μl含10 ng模板RNA的cDNA與5 μl的預混液(含1.5 μl Eva Green混合液，0.2 μl 10 μmol/L正向和反向特異性引物和3.3 μl H2O)混合，反應條件(95℃持續12 min，95℃持續10 s，60℃持續20 s，72℃持續20 s的38個循環)，miR-301a、ERα、均以U6為內參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt算法計算miR-301a、ERα mRNA相對表達量。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 免疫印跡法(Western blot)檢測相關蛋白表達情況：收集1.2.2中5組細胞，加入RIPA裂解液，充分裂解后用蛋白提取試劑盒(貨號：AM1556，購自賽默飛世爾中國公司)提取總蛋白。使用BCA蛋白試劑盒(貨號：23227，購自賽默飛世爾中國公司)測定細胞中總蛋白濃度。將50 μg總蛋白溶解在聚丙烯酰胺(SDS)凝膠上,并印跡到硝酸纖維素膜(BioRad)上，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h后。加入適宜濃度的一抗[ERα(貨號：K15071-KFE，購自北京百奧萊博科技)、PR(貨號：hz273Hu01,購自上海滬震)、GREB1(貨號：bs-3854R-1,購自北京博奧森)、N-cadherin(bs-1172R-1，購自北京博奧森)、Vimentin(貨號：abs44057644，購自上海愛必信)，各抗體濃度分別為1∶1 000]，室溫孵育2 h，洗滌后加入二抗(辣根過氧化物酶)，室溫孵育1 h，洗滌，以β-actin(貨號：sc-365062，購自圣克魯斯生物技術公司)為內參，通過ECL(貨號：P0018FA，購自上海碧云天)顯影，Alpha凝膠成像系統(New Discovery公司)照相并分析灰度值。每組實驗重復6次。

2 結果

2.1 雙熒光素酶法檢測miR-301a與ERα關系 miRtarbase預測顯示，miR-301a與ERα有結合位點。雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與miR-301a NC組+ERα-3’UTR-WT組(1.11±0.31)比較，miR-301a mimics+ERα-3’UTR-WT組(0.46±0.11)熒光素酶活性降低(P<0.05)，miR-301a NC+ERα-3’UTR-MUT組(1.10±0.29)及miR-301a mimics+ERα-3’UTR-MUT組(1.12±0.30)熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 miRtarbase預測miR-301a靶基因a

2.2 5組細胞侵襲情況 與Control組侵襲細胞數(263.62±25.31)相比，miR-301a mimics組侵襲細胞數(372.52±22.17)顯著升高(P<0.05)；miR-301a inhibitiors組侵襲細胞數(105.65±24.56)顯著降低(P<0.05)；miR-301a MNC組(261.88±23.27)及miR-301a INC組(261.88±24.27)與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表2。

Control組miR-301aMNC組miR-301aINC組miR-301a mimics組miR-301a inhibitiors組

表2 5組細胞侵襲情況 n=6，個，

2.3 5組細胞miR-301a、ERα miRNA相對表達水平 與Control組相比，miR-301a mimics組miR-301a表達升高(P<0.05)，ERα miRNA表達降低(P<0.05)；miR-301a inhibitiors組miR-301a表達降低(P<0.05)，ERα miRNA 表達升高(P<0.05)；miR-301a MNC組及miR-301a INC組與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 5組細胞miR-301a、ERα miRNA相對表達水平的影響

2.4 5組細胞ERα通路相關蛋白表達的影響 與Control組相比，miR-301a mimics組ERα、PR、GREB1蛋白表達降低(P<0.05)；miR-301a inhibitiors組ERα、PR、GREB1蛋白表達升高(P<0.05)，miR-301a MNC組及miR-301a INC組與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

表4 5組ERα、PR、GREB1蛋白表達情況

2.5 5組細胞中EMT標志蛋白的影響 與Control組相比，miR-301a mimics組N-cadherin、Vimentin蛋白表達升高(P<0.05)；miR-301a inhibitiors組N-cadherin、Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)，miR-301a MNC組及miR-301a INC組與Control組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表5，圖4。

圖3 5組ERα、PR、GREB1蛋白表達免疫印跡圖；A Control組；B miR-301a MNC組；C miR-301a INC組；D miR-301a mimics組；E miR-301a inhibitiors組

表5 5組N-cadherin、Vimentin蛋白表達情況

圖4 5組細胞N-cadherin、Vimentin蛋白表達免疫印跡圖；A Control組；B miR-301a MNC組；C miR-301a INC組；D miR-301a mimics組；E miR-301a inhibitiors組

3 討論

乳腺癌已成為威脅女性健康的第一大殺手，miR-301a的表達與腫瘤發展、轉移和總體預后不良有關。Yin等[6]發現miR-301a上調是三陰性乳腺癌細胞增殖和侵襲的關鍵因素。本研究發現，MCF7細胞過表達miR-301a后，MCF7侵襲細胞數目顯著高于Control組，而抑制miR-301表達后，MCF7侵襲細胞數目顯著低于Control組，進一步證實miR-301a參與MCF7細胞侵襲惡性行為學過程。

超過50%的乳腺癌患者被診斷出為雌激素陽性癌癥[7]，雖然用抗雌激素藥物他莫昔芬進行治療有效且耐受性好，但由于患者雌激素受體喪失，仍有 30%～40%的患者因癌細胞復發轉移而死亡[8]。研究發現，ERα的表達可被認為是乳腺癌生存的良好指標，而ERα的丟失表明乳腺癌細胞侵襲性較高和患者預后不良[9]。且ERα可調控下游靶基因PR和GREB1表達參與雌激素信號傳導，并調控EMT相關指標E-cadherin及Vimentin蛋白表達，來參與乳腺癌細胞EMT發展及侵襲等惡性行為學過程[10]，預示ERα可作為乳腺癌治療效果和判斷預后的重要指標。有研究發現，miR-301a能夠抑制雌激素受體ER陽性乳腺癌細胞中的ER信號傳導[11]，提示miR-301a與ERα可能共同參與乳腺癌雌激素受體傳導過程。本研究給乳腺癌MCF7細胞轉染miR-301a激動劑和抑制劑后發現miR-301a mimics組細胞，miR-301a表達高于Control組，而ERα mRNA和蛋白及介導的雌激素信號傳導通路蛋白PR、GREB1顯著降低，EMT相關指標E-cadherin及Vimentin蛋白表達均增高，提示過表達可抑制ERα介導雌激素信號傳導通路激活，促進乳腺癌侵襲及EMT發展，這可能是ERα丟失導致乳腺癌預后不良的可能原因。而miR-301a inhibitiors組細胞，miR-301a表達異常低于Control組后，ERα mRNA和蛋白及其介導的雌激素信號傳導通路蛋白PR、GREB1卻明顯升高，細胞侵襲及EMT進程也明顯受到抑制，表明miR-301a可能通過靶向作用于ERα，通過ERα介導雌激素信號傳導通路活化來參與乳腺癌侵襲及EMT過程。本研究發現轉染miR-301a mimics與WT-ERα后，雙熒光素酶活性明顯抑制，提示miR-301a對MCF7細胞中ERα基因發揮抑制作用。

綜上所述，miR-301a過表達可抑制ERα及相關通路蛋白表達，促進癌細胞侵襲和EMT，抑制miR-301a表達，可上調ERα及相關通路表達，抑制癌細胞侵襲和EMT。miR-301a可能作為MCF7細胞雌激素受體的潛在靶標。