巴豆生物堿調控miR-4317對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響及機制

孔令甲 趙維波 劉英超 李培哲

結直腸癌是臨床常見的一種消化系統惡性腫瘤，全球發病率較高，放化療等治療手段存在不良反應，多種天然藥物具有安全性高、多靶點與不良反應小等特點，因而從中藥與天然藥物中尋找治療結直腸癌的藥物具有重要意義[1-4]。巴豆生物堿(crotonic alkaloids，CA)是從大戟科巴豆中提取的一種活性成分，研究表明巴豆生物堿可誘導卵巢癌細胞周期阻滯而抑制細胞增殖并可促進細胞凋亡[5]。但對于巴豆生物堿與結直腸癌相關研究報道筆者未見報道。微小RNA(microRNA，miRNA)可能通過靶向結合mRNA的3’UTR而抑制靶基因翻譯或抑制其表達從而調節細胞生長及轉移等生物學行為，研究表明miR-4317在乳腺癌組織和細胞中表達降低，過表達miR-4317可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6]。而miR-4317在結直腸癌中的作用尚未可知。因此，本研究探討巴豆生物堿對結直腸癌細胞增殖和凋亡的影響、miR-4317在結直腸癌的作用以及巴豆生物堿對miR-4317的調控作用，為結直腸癌治療藥物的研發提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 巴豆生物堿購自武漢谷歌生物(純度≥99%)；人結直腸癌細胞SW620購自武漢普諾賽生命；MTT、RNA提取試劑、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen；反轉錄與熒光定量PCR試劑購自北京天根生化；miR-4317寡核苷酸模擬物(miR-4317 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-4317特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-4317)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物；兔抗人cleaved-caspase3、cleaved-caspase9抗體與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理及分組：對數生長期SW620細胞(2×105個/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，待生長融合至70%時每孔加入不同濃度(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)巴豆生物堿的DMEM培養基培養24 h[7]，記為CA-L組、CA-M組、CA-H組；將正常培養的SW620細胞記為Con組。按照Lipofectamine2000說明書轉染，miR-NC、miR-4317 mimics分別轉染至SW620細胞，分別記為miR-NC組、miR-4317組。anti-miR-NC、anti-miR-4317分別轉染至SW620細胞，轉染成功后加入100 μg/ml巴豆生物堿處理24 h，分別記為CA+anti-miR-NC組、CA+anti-miR-4317組。

1.2.2 MTT檢測細胞增殖：收集各組SW620細胞(2×104個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，每孔加入MTT溶液20 μl，培養4 h后3 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光孵育5 min，酶標儀檢測各孔吸光度值(A值)，細胞增殖抑制率=實驗組A/Con組A。

1.2.3 平板克隆形成實驗：收集各組SW620細胞接種于6孔板(500個/孔)，于37℃培養箱培養14 d，甲醇固定20 min，1%結晶紫染色液染色15 min，流動水洗滌后晾干，于顯微鏡下統計細胞(>50個為1個集落)克隆形成數。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率：收集各組SW620細胞加入預冷PBS洗滌，按照凋亡檢測試劑盒說明書檢測細胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR檢測miR-4317表達水平：提取各組SW620細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，加入DEPC水稀釋20倍后進行qRT-PCR反應，按照試劑盒說明書操作并應用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測Ct值并采用2-ΔΔCt法計算miR-4317相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表達量：提取各組SW620細胞總蛋白，SDS-PAGE后轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)一抗稀釋液4℃孵育24 h，加入二抗稀釋液(1∶3 000)室溫孵育1 h，滴加ECL顯影，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結果

2.1 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞增殖的影響 與Con組比較，CA-L組、CA-M組、CA-H組細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，細胞克隆形成數減少(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞增殖的影響

2.2 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞凋亡的影響 與Con組比較，CA-L組、CA-M組、CA-H組細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1，表2。

圖1 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞凋亡的影響

2.3 4組細胞miR-4317表達水平比較 與Con組比較，CA-L組、CA-M組、CA-H組miR-4317的表達量升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表3。

表3 巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞miR-4317表達的影響

2.4 過表達miR-4317對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-4317組細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，細胞克隆形成數減少(P<0.05)，細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 過表達miR-4317對結直腸癌SW620細胞凋亡的影響；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表4 過表達miR-4317對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的影響

2.5 干擾miR-4317表達逆轉了100 μg/ml巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用 與CA+anti-miR-NC組比較，CA+anti-miR-4317組細胞增殖抑制率降低、細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平降低(P<0.05)；細胞克隆形成數增多(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 干擾miR-4317表達逆轉了巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞增殖和凋亡的作用

圖3 干擾miR-4317表達逆轉了巴豆生物堿對結直腸癌SW620細胞凋亡的作用；A 凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

3 討論

部分中藥可抑制結直腸癌細胞生長及轉移，但其具體作用機制尚未闡明[8]。miRNA在結直腸癌中表達異常，并調節細胞生物學行為從而抑制或促進結直腸癌的發生及發展，還可能作為結直腸癌治療的潛在靶點[9,10]。

巴豆生物堿可抑制宮頸癌細胞增殖及促進細胞凋亡從而減緩宮頸癌的發展進程[11]。巴豆生物堿可誘導肝癌細胞凋亡并抑制細胞生長[12]。巴豆生物堿可通過下調PCNA和Ki-67蛋白抑制胃癌細胞增殖，可通過上調Bax和Fas蛋白誘導胃癌細胞凋亡[13]。巴豆提取物對腫瘤生長具有明顯抑制作用，并可促進細胞凋亡[14]。

本研究結果顯示，巴豆生物堿可以濃度依賴性的方式增高結直腸癌細胞增殖抑制率，減少細胞克隆形成數，提示巴豆生物堿可抑制結直腸癌細胞增殖及克隆形成。本研究結果顯示，巴豆生物堿可升高結直腸癌細胞凋亡率和cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白水平，且呈劑量依賴性，提示巴豆生物堿可促進結直腸癌細胞凋亡。

臨床胃癌標本中的miR-4317顯著降低，過表達miR-4317可抑制胃癌細胞增殖并阻斷S-G2/M轉換[15]。miR-4317在非小細胞肺癌組織和血清中表達下調，miR-4317高表達的非小細胞肺癌患者具有更高的總生存率，上調miR-4317可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，并阻礙細胞周期[16]。miR-4317在胃癌組織中呈低表達，并可能作為胃癌診斷及判斷患者預后的潛在生物學標記物[17,18]。miR-4317在乳腺癌組織和細胞系中的表達降低，其下調與淋巴結轉移、TNM分期和不良預后顯著相關，過表達miR-4317可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而下調miR-4317則相反[19]。

本研究結果顯示，隨著巴豆生物堿濃度的升高，結直腸癌細胞中miR-4317的表達量升高，提示巴豆生物堿可能通過促進miR-4317表達而發揮抗結直腸癌作用。本研究結果顯示，miR-4317過表達后結直腸癌細胞增殖抑制率升高，細胞克隆形成數減少，細胞凋亡能力增強，而干擾其表達可降低巴豆生物堿對結直腸癌細胞增殖及凋亡的作用。提示巴豆生物堿可通過促進miR-4317表達而調節結直腸癌細胞增殖及凋亡。

綜上所述，巴豆生物堿可抑制結直腸癌細胞增殖及克隆形成并可促進結直腸癌細胞凋亡，其作用機制與上調miR-4317的表達有關，miR-4317可能作為巴豆生物堿治療結直腸癌的潛在作用靶點，還可為進一步揭示巴豆生物堿抗結直腸癌的分子機制奠定實驗基礎。但關于其具體作用機制尚需進一步探究。