CD68、CD11c和CD163陽性巨噬細胞在乳腺癌組織中表達及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

汪園圓，朱 丹，杜光燁

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起基本作用，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophage, TAM)作為炎癥與腫瘤相關(guān)性的重要調(diào)節(jié)者，是腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細胞，在連接慢性炎性介質(zhì)反應(yīng)與腫瘤之間發(fā)揮重要的橋梁作用，參與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，特別是與腫瘤血管和淋巴管的生成密切相關(guān)[1-3]。有研究顯示TAM有可能成為腫瘤治療的新靶點，在未來的腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[4-5]。TAM可極化并表現(xiàn)出M1或M2表型[6]。其中M1型具有促炎功能，并激活輔助T細胞以誘導(dǎo)針對病原體的致死性T細胞反應(yīng)，限制腫瘤生長[7]。M2型可產(chǎn)生抗炎細胞因子，參與血管發(fā)生和腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細胞向M2表型分化，從而促進腫瘤的發(fā)展，被認為是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標志[7-8]。因此，這些TAM種類分布的平衡決定了巨噬細胞成分的抗腫瘤或促腫瘤作用。CD68是通用型巨噬細胞的經(jīng)典標志物，可識別M1和M2型；CD163是M2型巨噬細胞的高度特異性標志物[9-10]；CD11c近年來被認為是M1型巨噬細胞的標志物[11]。目前，國內(nèi)尚未見CD11c被用于原發(fā)性乳腺癌中TAM標志物的報道。本實驗檢測81例乳腺癌組織中CD68、CD11c和CD163的表達，通過將腫瘤間質(zhì)(tumor stroma, TS)中的TAM(M1、M2)進行量化、分組，分析比較兩組臨床病理特征、生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2017年12月上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院病理科存檔的81例乳腺癌標本，所有患者術(shù)前均未行放、化療及其它相關(guān)腫瘤的治療。患者年齡30～84歲，中位年齡62歲。根據(jù)患者的病歷和病理報告收集患者的臨床病理資料，包括患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學等級和隨訪數(shù)據(jù)。按WHO(2012)乳腺腫瘤分類標準及第7屆美國癌癥聯(lián)合委員會分期標準對81例患者HE切片進行病理及臨床診斷，81例患者均獲得隨訪資料，隨訪時間5～45個月，中位隨訪時間35個月。另收集同期50例乳腺腺病石蠟標本作為對照組。

1.2 方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，5～6 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、梯度乙醇入水。95～99 ℃抗原修復(fù)液中處理20 min，室溫冷卻30 min。濃縮型兔抗人巨噬細胞CD68、CD163、CD11c多克隆抗體購自Ventana Medical Systems檢測試劑盒，即用型鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體和免疫組化試劑盒(EnVision兩步法)購自上海杰浩公司。室溫下2 h或4 ℃孵育過夜。二抗為室溫下孵育30 min。檢測CD68、CD163、CD11c表達，分別計數(shù)TAM的總量及M1和M2的數(shù)量，明確乳腺癌組織中TAM的分化情況。

通過計數(shù)陽性巨噬細胞的數(shù)目確定CD68、CD11c和CD163的表達。在審查了每種情況下包含核心的TAM載玻片后，選擇最大表達強度的區(qū)域。在每種情況下，使用ImageScope(Aperio Technologies，Vista公司，USA)選擇了陽性TAM浸潤密度最高的3個視野，最終放大倍數(shù)為400×(1 mm2)。在3個視野中計數(shù)陽性巨噬細胞數(shù)，僅計數(shù)具有單核細胞/巨噬細胞樣形態(tài)的細胞，取平均值。為進行統(tǒng)計評估，根據(jù)截止點在TS中分別對CD68+、CD11c+或CD163+TAM進行計數(shù)，按M2/M1比率中位數(shù)0.8為界，分為高M2/M1表達組和低M2/M1表達組，分析兩組臨床病理特征之間的相關(guān)性。評估CD68+、CD11c+或CD163+TAM對乳腺癌中TS的影響。

1.3 隨訪從患者術(shù)后出院即開始隨訪，主要以門診和電話形式進行隨訪，隨訪截至2020年8月31日。總生存期(overall survival, OS)定義為從腫瘤確診至與腫瘤相關(guān)原因或死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，樣本率的比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征81例乳腺癌中，導(dǎo)管原位癌15例(15/81，18.5%)，浸潤性導(dǎo)管癌61例(61/81，75.3%)，浸潤性小葉癌5例(5/81，6.2%)。組織學分級：Ⅰ級10例(10/81，12.3%)，Ⅱ級59例(59/81，72.8%)，Ⅲ級12例(12/81，14.8%)。TNM分期：T1期15例(15/81，18.5%)，T2期45例(45/81，55.6%)，T3期17例(17/81，21.0%)，T4期4例(4/81，4.9%)。發(fā)病年齡30～84歲，中位年齡62歲。接受乳房切除術(shù)的患者66例(66/81，81.5%)，接受保乳手術(shù)的患者15例(15/81，18.5%)。術(shù)后71例患者(71/81，87.7%)行放、化療或內(nèi)分泌治療。所有患者中位隨訪時間35個月(5～45個月)，其中有13例(13/81，16.0%)死亡，16例(16/81，19.8%)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

2.2 TAM在乳腺癌中計數(shù)的比較對81例乳腺癌組織進行免疫組化染色，用CD68標記TS中巨噬細胞(圖1)；用CD11c標記巨噬細胞，CD11c陽性計數(shù)為M1細胞(圖2)；用CD163標記巨噬細胞，CD163陽性計數(shù)為M2細胞(圖3)。樣本中M1和M2細胞計數(shù)結(jié)果見圖4，通過統(tǒng)計分析，把TS中M1和M2的分化進行量化，M2/M1的比值結(jié)果數(shù)值見圖5。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

圖4 不同乳腺癌患者中TAM及M1和M2細胞數(shù)量

圖5 不同乳腺癌患者中M2/M1比率

2.3 乳腺癌中M2/M1比率與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系81例乳腺癌患者，腫瘤體積中位數(shù)為31.5 cm3，體積范圍2～120 cm3。高M2/M1表達組和低M2/M1表達組在病理分級、AJCC分級方面差異有顯著性(P<0.05，表1)。Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，高M2/M1表達組乳腺癌患者的OS低于低M2/M1表達組，兩者差異有顯著性(P<0.001，圖6)。

表1 乳腺癌中M2/M1比率和臨床病理特征的關(guān)系

圖6 M2/M1比率與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

乳腺癌作為威脅女性身心健康的常見腫瘤，是引起女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，目前全球乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位[12]。炎癥與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有一定的相關(guān)性，TAM作為腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細胞，是炎癥與腫瘤相關(guān)性的重要調(diào)節(jié)者，巨噬細胞極化成M1或M2表型會導(dǎo)致細胞因子分泌和功能發(fā)生變化。M1巨噬細胞產(chǎn)生IL-12和腫瘤壞死因子，在細胞中具有致命的抗微生物和抗腫瘤作用。M2巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，包括IL-10、Ⅱ型IL-1受體拮抗劑和IL-1誘餌受體。它們調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫，并促進血管生成和組織修復(fù)。由于IL-10的分泌和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，TAM在功能上類似于M2巨噬細胞。通過表達M2巨噬細胞的特征，TAM促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6]。由此可見，M1、M2種類分布的平衡決定了巨噬細胞成分的抗腫瘤或促腫瘤作用，本實驗通過標記及計數(shù)M1、M2，探尋其與乳腺癌臨床病理學參數(shù)、預(yù)后之間的關(guān)系。

CD68是最著名的泛巨噬細胞標志物，通常用作TAM的標志物[13]。既往研究顯示，在乳腺癌CD68+TAM高浸潤與腫瘤大小和預(yù)后不良相關(guān)[13-15]；提示乳腺癌與TAM相互作用并誘導(dǎo)支持腫瘤生長的免疫應(yīng)答。CD68+TAM浸潤與乳腺癌、子宮頸癌和膀胱癌的不良預(yù)后相關(guān)，但與前列腺癌、肺癌和腦瘤的預(yù)后良好有關(guān)[16]。這些結(jié)果可能是由于M1和M2巨噬細胞的CD68表達相似有關(guān)。本實驗將對CD68+TAM進一步分類標記為M1、M2。

CD163是M2巨噬細胞的最佳標記[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中大量CD163+TAM與快速增殖、分化差、ER陰性和導(dǎo)管組織學類型有關(guān)，較高的CD163+TAM數(shù)量與預(yù)后不良、組織學分級高、腫瘤體積較大、Ki-67增殖指數(shù)高、ER和PR陰性有關(guān)[17-18]。高級別腫瘤可能分泌更高水平的單核細胞集落刺激因子，IL-10和(或)TGF-β，從而導(dǎo)致CD163+TAM數(shù)量眾多[17]。考慮到M2巨噬細胞通過產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子和細胞外基質(zhì)重塑蛋白在腫瘤進展中起作用[18]，CD163+TAM數(shù)目的增加可解釋不良的預(yù)后。

已知腫瘤浸潤的成熟樹突狀細胞預(yù)后良好。然而，未成熟的樹突狀細胞與預(yù)后并不相關(guān)[19]。CD11c在與髓樣和單核細胞相關(guān)的樹突狀細胞，自然殺傷細胞，巨噬細胞乃至一些活化的B和T細胞中都過表達[20]。在本實驗中乳腺癌中M2/M1比率和腫瘤臨床指標的關(guān)系存在有一定的相關(guān)性。高M2/M1染色組和低M2/M1染色組在病理分級、AJCC分級、OS方面差異有顯著性(P<0.05)。由此可見腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)巨噬細胞向M2表型分化，促進腫瘤發(fā)展，是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標志，而TS中CD11c+TAM可提示預(yù)后良好。

本實驗檢測乳腺癌TS中CD68+或CD163+TAM表達，結(jié)果顯示兩者浸潤與臨床病理特征相關(guān)，并與OS不良有關(guān)，TS中CD11c+TAM的浸潤與OS良好有關(guān)。有研究表明TS中CD68+TAM與臨床病理特征或生存相關(guān)[14]，而不是腫瘤巢(TN)中的CD68+TAM，這與本實驗相似。然而，既往在黑色素瘤中的研究表明，TN中CD68+TAM浸潤與較差的OS和無瘤生存期有關(guān)[21]。在子宮內(nèi)膜癌中，TN中CD68+TAM浸潤與復(fù)發(fā)率降低呈正相關(guān)[22]。本實驗建議在檢查惡性腫瘤中的TAM時，還應(yīng)考慮其定位情況。

綜上所述，乳腺癌中包括M2巨噬細胞在內(nèi)的TAM與腫瘤進展有關(guān)。TS中CD68+或CD163+TAM浸潤提示乳腺癌患者預(yù)后不良，而TS中CD11c+TAM可提示預(yù)后良好。此外，除了分析TAM的浸潤程度外，了解TAM的位置對于評估患者預(yù)后亦很重要。