豬肺炎支原體CJ株的分離與鑒定

候 鳳,王 鋼,李新蘋,曹 劍,王鵬江,袁 科,賀 筍

(天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830011)

豬支原體肺炎又稱豬地方性流行肺炎，我國俗稱豬氣喘病[1]，是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)引起的一種慢性、接觸性、呼吸道傳染病[2]。主要臨床癥狀是連續(xù)咳嗽和腹式呼吸。剖檢變化為肺的尖葉、心葉、膈葉前緣以及中間葉發(fā)生“肉樣”或者“胰樣”實(shí)變。發(fā)病多呈慢性經(jīng)過，常有其他病菌(如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等)繼發(fā)感染[3-4]。由于帶菌病豬生長發(fā)育緩慢，生長率降低，飼料轉(zhuǎn)化率降低，造成飼料和人力的浪費(fèi)。帶菌病豬也可能成為僵豬或繼發(fā)感染死亡，屠宰場檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)屠宰豬40%～80%有典型的豬支原體肺炎病變。此外，豬肺炎支原體能夠引起機(jī)體免疫抑制，致使其他疫苗免疫失敗[5-6]。

本試驗(yàn)通過采集新疆昌吉某豬場疑似豬肺炎支原體感染的病變肺臟，進(jìn)行了豬肺炎支原體的分離，并對其進(jìn)行了分離、培養(yǎng)、PCR鑒定、測序分析、生化鑒定、生長抑制試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)，成功分離獲得了1株豬肺炎支原體分離株，命名為CJ株。

1 材料與方法

1.1 病料來源 來自新疆昌吉某豬場發(fā)病的豬，采集肺臟，共30份。

1.2 培養(yǎng)基 改良Friis培養(yǎng)基由天康生物股份有限公司制備。

1.3 陰性、陽性血清 豬肺炎支原體J株兔抗血清和豬鼻支原體兔抗血清及其陰性血清，均由天康生物股份有限公司制備。

1.4 試驗(yàn)動物 3～4周齡健康易感仔豬(PRRSV病原和抗體均為陰性，Mhp病原和抗體均為陰性)。

1.5 試劑 核酸提取試劑(TaKaRa)，PCR試劑(TaKaRa)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒(世紀(jì)元亨)，豬肺炎支原體ELISA抗體檢測試劑盒(IDEXX)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗體檢測試劑盒(IDEXX)。

1.6 菌株的分離和純化 將采集的30份病料的暗紅色病變處使用手術(shù)剪去除表面組織，剪取肺組織并置于組織研磨器內(nèi)，加入改良Friis液體培養(yǎng)基后研磨組織，制作成肺組織乳劑。將含肺組織乳劑的試管靜置，收集上清液，接種于含50%豬鼻支原體特異性血清的改良Friis液體培養(yǎng)基中，置36～38 ℃條件下培養(yǎng)，每隔5 d盲傳1次，每日觀察培養(yǎng)基pH變化。取0.2 mL培養(yǎng)物涂布于改良Friis固體培養(yǎng)基平板表面，置36～38 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個菌落接種于改良Friis液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基顏色變黃后取培養(yǎng)物涂布于改良Friis固體培養(yǎng)基平板表面，置36～38 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)，如此進(jìn)行純化培養(yǎng)2次。將最后1次純化培養(yǎng)生長的菌落接種改良Friis液體培養(yǎng)基，所得的顏色變黃培養(yǎng)物保存于-70 ℃以下備用。

1.7 PCR鑒定

1.7.1 引物設(shè)計與合成 PCR反應(yīng)引物參考文獻(xiàn)[7-8]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR amplification primers

1.7.2 DNA的提取 用TaKaRa細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。

1.7.3 PCR反應(yīng) 反應(yīng)液總體積為25 μl。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 μmol/L 引物P1 0.5 μL，10 μmol/L引物P2 0.5 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，加入雙蒸水17 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；2～8 ℃保存。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.7.4 多重PCR反應(yīng) 反應(yīng)液總體積為50 μL。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10×Buffer 5.0 μL，上游引物均為8 pmol，下游引物為12 pmol，ExTaq聚合酶0.5 μL，加入雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；2～8 ℃保存。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.7.5 序列比對 PCR反應(yīng)目的片段用凝膠回收試劑盒回收，將其克隆至pMT19-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由生工生物工程(上海)股份有限公司測序，并進(jìn)行基因序列比較分析。

1.8 生化試驗(yàn) 參照《獸醫(yī)微生物學(xué)》進(jìn)行溶血試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、精氨酸水解試驗(yàn)、薄膜和斑點(diǎn)形成試驗(yàn)和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。

1.9 生長抑制試驗(yàn) 將直徑6 mm濾紙片用未經(jīng)稀釋的豬肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株J株兔抗血清浸濕后，放入平板內(nèi)干燥待用。吸取待檢菌液0.5 mL涂布于固體培養(yǎng)基上，夾取抗血清紙片貼于瓊脂表面，36～38 ℃培養(yǎng)14 d。正常兔血清處理的紙片作為陰性對照。在低倍鏡下觀察，當(dāng)濾紙片周圍無菌落生長，出現(xiàn)抑菌圈大于1.0 mm者表示該菌種與抗血清系免疫原同種，小于1.0 mm者判為異種。

1.10 致病性試驗(yàn) 選取6頭4～5周齡健康易感仔豬，其中攻毒組3頭氣管注射分離株菌液，5 mL/頭，另3頭設(shè)為對照組，不做任何處理，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。攻毒后每日定時觀察仔豬的臨床癥狀，攻毒后28 d，將所有試驗(yàn)動物處死并剖檢，觀察肺臟病理變化，參照文獻(xiàn)[9]對每頭豬肺炎病變進(jìn)行評分。

1.11 攻毒豬病變肺中豬肺炎支原體的再分離 同1.6和1.7的方法從攻毒豬病變肺中進(jìn)行豬肺炎支原體的再分離和鑒定。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定 從昌吉豬場采集的30份病料進(jìn)行PCR檢測，其中有19份病料擴(kuò)增出豬肺炎支原體長度約427 bp目的片段，結(jié)果見圖1和圖2。得到的P36基因片段通過NCBI上BLAST比對后，其與J株、168株、232株、7448株同源性為99.67%，進(jìn)一步確定培養(yǎng)物為豬肺炎支原體。

圖1 病料1～18用PCR檢測豬肺炎支原體結(jié)果Fig.1 PCR detection results of Mycoplasma hyopneumoniae in diseased samples 1-18M： DL2 000 Marker； -： 陰性對照； +： 陽性對照(J株)； 1～18： 病料樣品 M: DL2 000 Marker; -: Negative control; +: Positive control (J strain); 1-18: Diseased samples

圖2 病料19～30用PCR檢測豬肺炎支原體結(jié)果Fig.2 PCR detection results of Mycoplasma hyopneumoniae in diseased samples 19-30M： DL2 000 Marker； -： 陰性對照； +： 陽性對照(J株)； 19～30： 病料樣品M: DL2 000 Marker; -: Negative control; +: Positive control (J strain); 19-30: Diseased samples

2.2 多重PCR鑒定 將19份豬肺炎支原體陽性病料經(jīng)過多重PCR檢測均擴(kuò)增出長度約為1 000 bp的豬肺炎支原體目的片段，但其中有13份陽性病料還擴(kuò)增出長度約為1 129 bp的豬鼻支原體目的片段，說明該13份病料混有豬鼻支原體，結(jié)果見圖3。

2.3 病料分離與培養(yǎng) 將檢測只含有豬肺炎支原體的6份病料的肺組織懸液接種改良Friis液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，連續(xù)傳至6～8代時，有1個分離株的培養(yǎng)物顏色變化時間穩(wěn)定在5～7 d，含菌量可達(dá)1.0×108CCU/mL。

圖3 19份病料多重PCR檢測結(jié)果Fig.3 Multiple PCR detection results of 19 diseased samplesM： DL2 000 Marker； -： 陰性對照； Mhp： 豬肺炎支原體(J株)陽性對照； Mhr： 豬鼻支原體陽性對照； Mfl： 豬絮狀支原體陽性對照； 1～19： 病料樣品M: DL2 000 Marker; -: Negative control; Mhp: Mycoplasma hyopneumoniae (J strain) positive control; Mhr: Positive control for Mycoplasma hyorhinis; Mfl: Positive control for Mycoplasma flocculus; 1-19: Diseased samples

2.4 培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)特性 分離株培養(yǎng)后呈輕度渾濁；將培養(yǎng)物涂片進(jìn)行吉姆薩染色，在1 000×油鏡下可見藍(lán)色濃染如沙粒大小的菌體。

2.5 生化試驗(yàn) 分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)菌株(J株)相同，符合豬肺炎支原體生化特性，生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表2。

2.6 生長抑制試驗(yàn) 將分離株接種改良Friis固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～10 d，肉眼可見針尖大小的菌落，顯微鏡下觀察為外周質(zhì)地疏松、中央致密的圓形菌落，表面粗糙帶有顆粒狀；且能被豬肺炎支原體特異性血清所抑制。證明分離株為豬肺炎支原體。

2.7 致病性試驗(yàn) 攻毒后連續(xù)觀察28 d，3頭仔豬出現(xiàn)咳嗽；攻毒28 d剖殺，攻毒組3頭仔豬出現(xiàn)豬支原體肺炎肺部病變，在肺臟心葉、尖葉、膈葉前1/3部位以及中間葉，出現(xiàn)“肉樣”或“胰樣”實(shí)質(zhì)樣病變，界限明顯。對照組沒有出現(xiàn)肺炎病變，且與攻毒組差異顯著(P<0.05)。攻毒組和對照組臨床癥狀和肺炎病變得分見表3。

表2 分離株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical test identification results of isolates

表3 分離株致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of pathogenicity test of isolates

2.8 攻毒豬病變肺中豬肺炎支原體的再分離 將攻毒組3頭仔豬的病變肺臟進(jìn)行病原的分離、傳代培養(yǎng)和鑒定。結(jié)果顯示，培養(yǎng)物pH下降，鏡檢有豬肺炎支原體特征的多形態(tài)菌體，經(jīng)PCR鑒定為豬肺炎支原體。

3 討論

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體引起的一種慢性接觸性傳染病，是豬呼吸道病綜合征的主要原發(fā)性病之一[10]。Mhp與豬呼吸道上皮細(xì)胞纖毛的特異性黏附是引起豬支原體肺炎的先決條件，并且其致病力與黏附特性密切相關(guān)，該病分布廣泛、發(fā)病率高，雖死亡率不高，但由于Mhp能破壞呼吸道黏膜-纖毛屏障，從而繼發(fā)其他致病菌的感染。大量研究表明：Mhp與其他病原體、環(huán)境因子具有協(xié)同感染的作用，且協(xié)同Mhp感染的病原體能增加相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和潛在的持久性，使呼吸道疾病加重，繼而引起呼吸系統(tǒng)疾病綜合癥，死亡率上升，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。

為了減少豬支原體肺炎對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失，國內(nèi)外許多學(xué)者進(jìn)行了廣泛研究，并取得了一定的成果。但豬肺炎支原體體外培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高且生長速度緩慢，分離過程中易受豬鼻支原體等的影響，導(dǎo)致豬肺炎支原體分離難度較大[13-15]。分離獲得該病的菌株將對該病的發(fā)病模型建立提供條件。本試驗(yàn)采集疑似豬肺炎支原體感染的病變肺臟，通過培養(yǎng)、PCR鑒定、序列分析、生化鑒定、生長抑制試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)，證實(shí)分離獲得1株豬肺炎支原體菌株，并命名為CJ株。分離株攻毒豬后可產(chǎn)生典型的豬支原體肺炎癥狀和病變，說明該分離株對豬具有一定的毒力。因此，該菌株可作為疫苗候選株進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)也將該菌株進(jìn)行了疫苗的制備和免疫原性評價。結(jié)果顯示，該菌株的免疫原性良好，該部分?jǐn)?shù)據(jù)未在文中展示。由該菌株生產(chǎn)的疫苗已于2017年上市，通過大群免疫試驗(yàn)證明該疫苗安全、有效，對國內(nèi)豬支原體肺炎疫病的防控起到了積極作用。