鯽魚源維氏氣單胞菌噬菌體的分離及生物學特性

戴瑜來,戴楊鑫,許寶青,林啟存,馬恒甲,蔡麗娟

(杭州市農業科學研究院,浙江 杭州 310024)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種人—獸—魚共患的條件致病菌[1]，該菌可感染草魚[2]、鯽[3]、泥鰍[4]、青蝦[5]、中華絨螯蟹[6]、中華條頸龜[7]、達氏鱘[8]、虹鱒[9]、大黃魚[10]等多種水生動物，引發的疾病發病快、死亡率高，對水產養殖業造成了巨大經濟損失。研究人員發現，維氏氣單胞菌對β-內酰胺類(氨芐西林鈉、苯唑西林)、大環內酯類(硫氰酸紅霉素、乙酰螺旋霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、氨基糖苷類(硫酸新霉素、卡那霉素)、四環素類(四環素、強力霉素)、磺胺類(磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素類(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌藥均產生了一定的耐藥性[11-15]，且極可能會隨著抗菌藥的繼續濫用而在水生動物臨床上更加快速且廣泛地傳播。同時，抗菌藥的廣譜性會破壞水體環境及養殖動物腸道中正常微生物群系的平衡，影響養殖魚類的生長發育，進而造成水產養殖效率低下。因此，尋找安全、高效、環保的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體(Baceriophage)是一類能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，它具有裂解宿主專一性強、研發時間短，不影響正常菌群，對人和動物安全，耐藥風險低且無環境污染等優點，其在細菌病防控領域的應用研究呈逐年上升趨勢[16]。目前，已報道用于水生動物細菌病防控的噬菌體研究數量有限，為了豐富水產致病菌的噬菌體庫，篩選具有潛在應用價值的菌株，本試驗以維氏氣單胞菌為宿主菌，分離篩選烈性噬菌體，研究其生物學特性，旨在為進一步探索噬菌體防控技術提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 維氏氣單胞菌(XJJYCA01)分離自發病鯽魚，LB斜面保存于4 ℃。

1.2 試劑與儀器 試劑耗材：LB培養基、SM液、接種環、5 mL注射器、0.22 μm過濾頭、一次性培養皿等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。儀器：UV-2600紫外分光光度計、離心機(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒溫水浴鍋、Hitachi H-7650型電子顯微鏡、JJ-Y系列電子天平、生化培養箱等。

1.3 噬菌體分離與純化 參照王志麗[17]的雙層平板法進行維氏氣單胞菌的富集、篩選、純化，略作修改。步驟如下：(1)無菌操作解剖，取發病鯽魚腸道置于滅菌培養皿中，用生理鹽水洗脫腸道內容物，4 000 r/min離心10 min后過0.22 μm濾頭備用；(2)挑取維氏氣單胞菌(XJJYCA01)單菌落接種到含有5 mL LB液體培養基的試管中，28 ℃ 120 r/min搖床上過夜培養；翌日，將其轉到含25～30 mL液體培養基的錐形瓶中，28 ℃ 120 r/min震蕩培養3 h，使其達到對數期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病魚腸道洗脫液，再28 ℃振蕩培養48 h。之后將混合液以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清轉移至另一無菌螺旋離心管后備用；(3)取100 μL分離液與200 μL對數期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷卻至45 ℃的半固體培養基中，混勻立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，28 ℃ 倒置培養24 h。翌日觀察噬菌斑的生成情況；(4)用滅菌牙簽挑取單個噬菌斑，接到5 mL液體培養基中富集10 min，然后向其中加入200 μL宿主菌菌液，28 ℃培養2～3 h至液體澄清后，12 000 r/min離心取上清，即得到高效價的噬菌體。

1.4 噬菌體效價的測定 采用噬斑法測定噬菌體效價。吸取100 μL純化的噬菌體液進行10倍稀釋，將稀釋的噬菌體液分別與200 μL的XJJYCA01混合，利用雙層平板法觀察噬菌斑的個數。效價(PFU/mL)=噬菌斑數×10×稀釋倍數。

1.5 噬菌體的電鏡觀察 參照Ramíre-orozco等[18]的方法，采用磷鎢酸負染法，用Hitachi H-7650型電子顯微鏡進行電鏡觀察。

1.6 噬菌體最適感染復數(MOI)測定 培養XJJYCA01至對數生長期(OD600≈0.5，約為1×108CFU/mL)，按照不同的感染復數(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液體培養基，28 ℃培養4 h。經培養后，9 000 r/min離心10 min，0.22 μm過濾。收集上清，測定噬菌體效價，以產生最高噬菌體效價的MOI為最佳感染復數。

1.7 一步生長曲線 參照柏琴琴[19]并略作修改。具體操作如下：將XJJYCA01培養至對數生長期。將噬菌體SJTJYCA01效價濃度稀釋到1×108PFU/mL。1 mL噬菌體稀釋液和10 mL宿主菌細菌懸液混合于錐形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培養液的錐形瓶P2中，混合均勻，再從錐形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液體培養基的P3中，混合均勻后在28 ℃及180 r/min條件下振蕩培養。從0開始每隔一段時間取樣。所取樣品經9 000 r/min離心2 min，取上清液用雙層平板法測定過濾液中噬菌體的效價。以取樣時間為橫坐標，噬菌體效價的對數值為縱坐標，繪制一步生長曲線。裂解量=裂解期平均噬菌體數/潛伏期平均噬菌體數。

1.8 熱穩定性及pH穩定性 將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，分裝到3個5 mL 離心管中，每管各裝3 mL。將離心管分別放置于40 ℃、60 ℃、80 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測定各管中噬菌體的效價，直至測到60 min。以SM液為介質，用NaOH和HCl調節pH(3～11)。將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，取10 μL加入到990 μL不同pH的SM液中，28 ℃水浴2 h后測定各離心管中噬菌體的滴度。每個pH試驗重復3次。

2 結果

2.1 噬菌體分離與純化 從發病鯽魚腸道中獲得的分離液經雙平板法后在平板上可見有大量噬菌斑產生，圖1A可見噬菌斑呈圓形，中間透明，邊緣清晰整齊，無暈環，但大小不一，分布不均勻，直徑在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在說明腸道分離液中有宿主菌的噬菌體存在。噬菌體經純化增殖后，梯度稀釋，用雙層平板法計數，該噬菌體的效價可達3.0×1012PFU/mL，噬菌體命名為SJTJYCA01。

圖1 噬菌體的噬菌斑(A)和超微形態圖(B)Fig.1 Plaque morphology (A) and TEM image (B) of phage

2.2 噬菌體的超顯微形態 通過電子顯微鏡觀察發現，本試驗分離的噬菌體為有尾噬菌體，屬于尾病毒目短尾噬菌體科，頭部直徑在45～60 nm，尾部長在16～26 nm，見圖1B。

2.3 最適感染復數 噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI為0.1時的效價最高(效價值達2.55×109)，說明噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最適感染復數為0.1。見表1。

表1 噬菌體SJTJYCA01的最適感染復數Table 1 Determination of optimal MOI of SJTJYCA01

2.4 一步生長曲線 一步生長曲線的結果見圖2，噬菌體SJTJYCA01的潛伏期為20 min，裂解期達40 min，裂解量為裂解期平均噬菌體數(14 458 PFU/mL)/ 潛伏期平均噬菌體數(255 PFU/mL)=57。

2.5 熱穩定性 在40 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率不隨時間的增加而減少；在60 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率僅為原噬菌體的3%；在80 ℃條件下，各個時間段均未見有噬菌體存活。見圖3。

圖2 噬菌體的一步生長曲線Fig.2 One-step growth curve of phage

圖3 噬菌體SJTJYCA01的熱穩定性Fig.3 Thermal stability of SJTJYCA01

2.6 pH穩定性 噬菌體SJTJYCA01對強酸強堿均較為敏感，在pH 5～10時較為穩定；噬菌體SJTJYCA01的最適pH 7。見圖4。

圖4 噬菌體SJTJYCA01的pH穩定性Fig.4 pH stability of SJTJYCA01

3 討論

近年來，國內外有關維氏氣單胞菌病例的報道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢，并已成為一種危害嚴重的人—獸—魚共患病原菌[20]。噬菌體作為一種新興的生物抑菌劑日漸受到學者們的關注[21]。目前，國內外關于維氏氣單胞菌噬菌體的研究鮮有報道，僅可見Taruna等[22]從池水中分離到維氏氣單胞菌的噬菌體VTCCBPA5和呂孫建等[23-24]從中華鱉養殖塘中分離得到的非特異性寬譜噬菌體NTHP01(以嗜水氣單胞菌為宿主分離獲得)。

本試驗以鯽魚源維氏氣單胞菌為宿主菌，從發病鯽魚的腸道中分離獲得噬菌體SJTJYCA01。該噬菌體在宿主菌上可形成圓形、透亮，具有典型烈性噬菌體特征的噬菌斑[25]；參照《病毒分類——國際病毒分類委員會第九次報告》，對噬菌體SJTJYCA01的形態進行觀察分析，結果可判定該噬菌體為尾病毒目短尾噬菌體科噬菌體(頭徑45～60 nm，尾長16～26 nm)，此與Taruna等[22]分離獲得的VTCCBPA5同屬于短尾噬菌體科(頭徑56 nm，尾長5 nm)，卻有別于呂孫建等[24]分離獲得的肌尾噬菌體科噬菌體NTHP01(頭徑60～145 nm，尾長80～455 nm)。因此，這是鯽魚源維氏氣單胞菌短尾科烈性噬菌體在中國的首次報道。

感染復數是研究噬菌體與宿主之間量化與產出的重要生物學指標，在不同感染復數條件下，噬菌體感染宿主菌后分裂得到的噬菌體子代的數量不同，因此，確定最適感染復數對于噬菌體進一步的應用研究具有重要作用。本試驗獲得噬菌體SJTJYCA01的最適感染復數為0.1，與王志麗[17]分離的鱉源氣單胞菌噬菌體的最適感染復數相同，說明該噬菌體裂解效率較高，少量的噬菌體侵染宿主菌即可產生噬菌體子代；噬菌體感染宿主菌的潛伏期和裂解期的長短及裂解量的大小通常與噬菌體、宿主菌及生長條件有關，從潛伏期可得知噬菌體吸附于細胞并釋放出子代噬菌體的最短時間，潛伏期和裂解量則是噬菌體增殖的2個特征性指標。噬菌體SJTJYCA01潛伏期和裂解期分別為20 min、40 min， 較噬菌體VTCCBPA5(潛伏期35 min)[22]、泥鰍源氣單胞菌的噬菌體pAh1(潛伏期30 min)[26]和鱉源氣單胞菌的噬菌體(潛伏期50 min)[17]要短，遠小于噬菌體NTHP01(潛伏期150 min)[23]，且同樣對宿主菌具有較高的裂解量。

目前，氣單胞菌屬細菌(包括維氏氣單胞菌)能造成多種水生動物發生運動性氣單胞菌敗血癥[27]，該病在浙江、湖南、湖北、江西等地的發病高峰期為每年的6～9月(養殖水溫在20～30 ℃，pH一般呈弱堿或弱酸性)，常常出現急性暴發病，嚴重時的死亡率可達90%以上。本試驗分離獲得的噬菌體SJTJYCA01在溫度低于40 ℃時能保持較好的穩定性和活性，并在pH 7附近最為穩定。因此，噬菌體SJTJYCA01能很好的適應水產養殖環境，在水生動物細菌性疾病防控中應用具有極大的可能性。本試驗篩選獲得的維氏氣單胞菌烈性噬菌體，不僅豐富了水產致病菌噬菌體的菌種資源，并將為噬菌體作為生物抑菌劑的開發應用提供科學依據。