計算機輔助精子分析在大熊貓精子濃度測定的應用

賴燕舞,楊 波,李曉燕,周 強,李 鳳,王 群, 唐 勇,唐 誠,謝術紅,周應敏,羅 波,黃 炎

(中國大熊貓保護研究中心 大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和 草原局重點實驗室,四川 都江堰 611830)

精子濃度是精液質量評估的一個重要指標，也是指征男性生育能力的最佳標志[1]。自1978年大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)人工授精技術首次在北京動物園應用成功以來[2]，人工授精技術已逐漸完善并作為圈養大熊貓人工繁育的重要技術手段，以彌補自然交配的雄性大熊貓數量不足、促進不能自然交配的雄性個體參與繁殖以及提高遺傳多樣性[3]，而人工授精的成功率與凍精的質量存在重要的關聯性[4-6]。精液的精子濃度決定了凍精的稀釋比例，一般做1～7倍稀釋[7]。因此，精子濃度不僅是衡量雄性大熊貓生殖能力指標，也是影響凍精質量以及人工授精成功率的重要因素。

既往采用常規精液分析(Semen routine analysis,SRA)對精液質量進行評估，該方法是一種傳統的分析方法，簡單且認可度高，但檢測時間較長，人為差異較大。20世紀80年代，計算機輔助精液分析(Computer aided semen analysis，CASA)已開始應用，如今越來越多的運用到公畜繁殖力評估[8]。CASA通過對精子動態圖像進行分析，并提供精子動力學的量化數據，檢測迅速、客觀、精確，已被廣泛應用在人類臨床精液質量的評估[9]。本試驗首次比較CASA與SRA兩種方法對大熊貓精子濃度檢測的結果是否具有差異性，以評估CASA在大熊貓精液質量分析中的準確性和應用性。

1 材料與方法

1.1 計數工具 全自動精子分析儀(邁朗ML-500 JZ，南寧松景天倫生物科技有限公司)；邁朗CASA精子計數板(板池深度=20 μm)；血細胞計數板(XB-K-25，25×16型，上海)。

1.2 精液的采集 于2018—2019年間，利用直腸電刺激采集14只雄性大熊貓精液，年齡8～20歲，均為參與繁殖的雄性個體。共得到26例大熊貓新鮮精液樣本。

1.3 計數方法

1.3.1 全自動精子分析儀 進行CASA時，將大熊貓新鮮精液用生理鹽水稀釋成1∶25、1∶50或1∶100，每個樣本制作2份稀釋液。混勻后取10 μl精液于CASA精子計數板池內，放于顯微鏡載物臺上靜置1 min，在10×10倍鏡下檢測。每份稀釋樣本掃描5～20個視野，至少檢測500條精子。分別用自動和手動2種模式進行檢測(自動模式：由計算機自動識別精子并進行統計分析；手動模式：人為識別精子并進行標注，再由計算機進行統計)。精子濃度=N1(平均每個視野下的精子個數)×0.386×106×稀釋度(25或50或100)。

1.3.2 血細胞計數板計數方法 進行SRA時，參考王亞民[10]使用血細胞計數板對精子進行計數。將1∶25、1∶50或1∶100的稀釋精液再稀釋成1∶200，同樣制作2份稀釋液?；靹蚝蠹尤胫裂毎嫈蛋逯小χ醒氪蠓礁襁M行精子計數(整個計數區)，精子濃度=N2(中央大方格精子個數)×104×200。

1.4 統計分析 計量資料以平均數±標準差(Mean±SD)表示。采用SPSS 22.0軟件對數據進行正態分布檢驗，各組數據均為正態分布，隨之進行配對樣本t檢驗，P<0.05表示差異顯著，具有統計學意義。

2 結果

2.1 精液稀釋度對CASA、SRA檢測結果的影響 將1例精液進行1∶5稀釋，再依次進行等比稀釋，最終稀釋成1∶1 280精液，各制作2份。依次對1∶5、1∶10、 1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1 280倍共9個稀釋度精液進行CASA和SRA分析。結果如圖1所示，隨著稀釋度的增加，CASA(自動模式)所得出的精子濃度也逐漸增大，整體的等比性較差，尤其表現在低稀釋度區間(1∶5、1∶10和1∶20)和高稀釋度區間(1∶320、1∶640和1∶1 280)。僅在1∶40、1∶80和1∶160稀釋度間呈現出較好等比性，所得精子濃度幾乎相同，分別為(2 509.0±32.8)×106/mL、(2 501.3±43.7)×106/mL和(2 593.9±87.3)×106/mL。CASA(手動模式)與SRA得出的結果呈現出波浪式波動，整體的等比性均較好。CASA(自動模式)與CASA(手動模式)在1∶40、1∶80、1∶160稀釋度間的重疊性較好，所得精子濃度基本相同。3種稀釋度下所對應的平均每個視野下的精子個數分別為163/166、81/82、42/42(CASA自動模式/手動模式)。

圖1 精液等比稀釋后的CASA和SRA分析結果Fig.1 CASA and SRA analysis results under geometric dilution of semen

2.2 CASA與SRA比較 精子濃度在10億以下的SRA、CASA(自動模式)和CASA(手動模式)檢測結果分別為(847.7±302.1)×106/mL、(955.3±408.8)×106/mL和(915.7±350.6)×106/mL；在10億～20億精子濃度區間內，檢測結果分別為(1 511.9 ±352.0)×106/mL、(1 582.9±393.5)×106/mL和(1 567.4±357.2)×106/mL；精子濃度在20億以上時，分別為(2 407.4±207.5)×106/mL、(2 840.5±561.9)×106/mL、(2 816±562.7)×106/mL。差異性分析顯示(圖2)，精子濃度在10億/mL以下，SRA與CASA(自動模式)和CASA(手動模式)的檢測結果均無顯著差異性(N<10=5；T<10=-0.916，-0.836；P<10=0.412，0.450)。精子濃度在10億～20億/mL范圍內，同樣不存在顯著差異性(N10～20=12；T10～20=-1.265，-1.257；P10～20=0.232，0.235)。而精子濃度在20億/mL 以上時，SRA與CASA(自動模式)和CASA(手動模式)均存在顯著性差異，具有統計學意義(N>20=9；T>20=-2.819，-2.684；P>20=0.023，0.028<0.05)。在3個濃度區間內的CASA(自動模式)與CASA(手動模式)均不存在顯著差異性(T<10=1.008，T10～20=0.628，T>20=0.787；P<10=0.370，P10～20=0.543，P>20=0.454)。

圖2 精子濃度在不同區間內的結果比較Fig.2 Results comparison of sperm concentration in different intenval*:差異性顯著(P<0.05)*:Significant difference (P<0.05)

2.3 大熊貓精子濃度分布 本試驗統計了中國大熊貓保護研究中心2006—2020年間參與繁育的雄性大熊貓的精子濃度情況(圖3)，共計71例精液樣本(包含本試驗測定的26例)。精子濃度由SRA分析得出。統計發現，大熊貓精子濃度為(1 715.2±1 134.2)×106/mL，且集中分布在5億～25億/mL(各濃度區間的百分比>10%)，占總體的78%以上。其中，10億～15億/mL 約占總體的3成。

圖3 大熊貓精子濃度分布情況Fig.3 Sperm concentration distribution of giant panda

表1 大熊貓精液稀釋度參考(CASA)Table 1 Dilution reference of semen in giant panda by CASA

3 討論

本試驗發現，利用CASA檢測精子濃度時，精液的稀釋度對檢測結果有直接影響。尤其是在自動模式下，當稀釋度過低，每個鏡下視野中精子個數過多，精子很可能發生重疊，進而影響對精子的識別，會導致結果偏低；稀釋度過高，鏡下精子數過少，計數誤差偏大(標準誤增大，圖1)。因此，針對于本試驗中的CASA系統，將每個視野下的精子個數控制在50～150個，CASA表現出較高的準確性。因此在實際操作中，可參考表1進行精液稀釋。

當大熊貓精子濃度在20億/mL以下時，2種方法檢測結果無顯著性差異；而當精子濃度>20億/mL 時，CASA檢測結果顯著高于SRP。可能是大熊貓精液中含有的巨噬細胞和被吞噬的衰亡精子及其碎片[11]，還包含非精子細胞、細胞碎片或精液內顆粒雜質等(大小與精子頭部相仿)，會導致計算機誤將其分析為精子，最終測定的結果遠大于實際精子濃度，這與高彩鳳等[9]得出的結論相似。CASA的自動與手動模式所得結果無差異表明，CASA對精子的識別性較好，可重復性好，而且在自動模式下可以對精子濃度進行快速、準確測定。常規精液分析往往受到檢測者技術熟練程度和主觀因素的影響，分析時間較長且無法測定精子的微細運動情況。而CASA很好地克服了主觀因素，不僅能夠客觀、快速地測定精子濃度與活力等質量參數，而且還能顯示單個精子的運動軌跡，提供精子動力學的量化數據，如直線/曲線速率、直線性、向前性、側擺幅度、鞭打頻率等，為精液質量評估提供更多的客觀參考指標[12-13]。因此，CASA在精液分析方面比傳統方法具有優越性。但是，CASA仍然存在一定的局限性，不能完全取代人工計數法。CASA在檢查過程中易受到諸多因素的影響，包括圖像清晰度、精液顆粒雜質情況、精子濃度、精液稀釋度、操作者熟練程度等，故CASA還需要進一步優化系統參數、熟練操作并同時結合常規分析方法，以確保檢測的精確性。

大熊貓精子濃度為(1 715.2±1 134.2)×106/mL，這與黃炎等[3,14-15]報道的結果相一致。相比其他動物而言，如非洲獅(Pantheraleo)的精子濃度為1.94×109/mL[16]、亞洲黑熊(Ursusthibetanus)為(13.90±8.19)×108/mL[17]、北極狐(Vulpeslagopus)為(1.95±1.07)×108/mL[18]、美洲豹(Pantheraonca)為(6.20±3.03)×106/mL[19]、云豹(Neofelisnebulosa)為2.7×106～8×106/mL[20]，大熊貓的精子濃度表現出很高的水平。而大熊貓精液中高水平的精子濃度，很可能是一種繁殖策略，以提高雌性個體的懷孕率，能夠產下后代。單從精子濃度上講，大熊貓可能擁有著不弱的生殖能力。

本試驗嘗試將CASA應用到大熊貓精子濃度分析，且表現出較好的應用性。同時，本試驗也為今后拓展大熊貓精液質量分析和精液質量控制標準，以及大熊貓精液質量評估體系的建立打下基礎。