牛腺病毒7型、牛支原體和細菌混合感染致外購肉牛呼吸系統疾病的確診

李 月,朱來萍,陶 松,詹建舉,余桃櫻,巖 銳,鄭碧妞,高 林, 謝佳芮,王生奎,楊仕標,姚 俊

(1.云南農業大學動物醫學院,云南 昆明 650201 ； 2.云南省怒江州貢山縣動物疫病預防與控制中心,云南 貢山 673500 ； 3.云南省普洱市孟連縣農業和科學技術局,云南 孟連 665800 ； 4.云南省怒江州瀘水市動物疫病預防與控制中心, 云南 瀘水 673199 ； 5.云南省畜牧獸醫科學院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室,云南 昆明 650224)

2017年8月,云南省昆明市尋甸縣某養殖戶從山東鄆城購進30頭西門塔爾雜交肉牛,在購進1周后陸續發生以呼吸系統癥狀為主要特征的疾病。臨床癥狀主要有呼吸急促、淺表，喘息，伴有啰音，偶有咳嗽，眼、鼻膿性分泌物增多，低熱(體溫39.5～40 ℃)，精神委頓，喜臥，食欲減退，反芻停止等，部分牛只伴有腹瀉。病理剖檢可見患牛氣管內有大量灰黃色黏稠分泌物，肺臟嚴重出血、肉變。發病牛群經抗生素、磺胺類藥物、板藍根及魚腥草注射液肌注治療，療效不佳，隨著病程發展開始出現死亡，截至9月末，共死亡25頭，僅有5頭自然耐過康復，病死率高達83.33%(25/30)。為了盡快查出病因，本試驗采集病死牛內臟組織病料進行牛腺病毒7型(BAdV-7)、3型(BAdV-3)，牛支原體(M.bovis)，牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛流行熱病毒(BEFV)、牛副流感3型(BPIV3)及多殺性巴氏桿菌病原檢測及序列分析，同時進行了牛支原體和細菌的分離鑒定，以期確診結果能為將來的防控和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 病死肉牛的肺門淋巴結、肺臟、脾臟及氣管分泌物。

1.1.2 主要儀器和試劑 病毒DNA/RNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Plus Taq酶、DNA Marker DL2 000，均購自天根生化科技(北京)有限公司；生物安全柜為ESCO/CLASS II TYPE A2；PCR 儀Gene Amp PCR System 9700、實時熒光定量PCR儀 7500 FAST SYSTEM及牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測商品化試劑盒(VetMAXTMIBR/BHV-1 Reagents)，均購自美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Inc.)；一步法RT-PCR試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；支原體篩選培養基(OXOID)，購自英國OXOID(Fisher)公司；法國梅里埃細菌生化及藥敏鑒定系統(ATB系統)、細菌生化鑒定試條ID 32GN及藥敏試條ATB VET，均購自法國生物梅里埃(BioMerieux)生物技術公司；營養瓊脂培養基、支原體肉湯培養基、革蘭染色液、瑞氏染色液，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Gibco新生犢牛血清，購自美國賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)。

1.1.3 引物 牛支原體16S rRNA基因特異性引物由云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室自行設計，委托生工生物工程(上海)技術服務有限公司合成。M.bovis套式引物(P1、P2、P3、P4)、BAdV-7、BAdV-3、BRSV、IBRV、BEFV、BPIV3及多殺巴氏桿菌的檢測引物及探針參考文獻[1-8]合成(表1)，以上引物及探針均分別委托英濰捷基(上海)生物技術有限公司和昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.1.4 實驗動物 24只昆明小鼠，購自昆明醫科大學實驗動物中心；4頭5月齡荷斯坦公犢牛，購自昆明市晉寧區某奶牛養殖農民專業合作社。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 取適量病死肉牛病變明顯的肺臟、肺門淋巴結及脾臟組織剪碎后加入適量生理鹽水充分研磨，移入離心管中反復凍融3次，置于-80 ℃備用；采集病死肉牛氣管分泌物裝入50 mL離心管中，加入適量生理鹽水稀釋后充分震蕩，反復凍融3次，置于-80 ℃備用。

1.2.2 樣品核酸提取 取1.2.1中處理的組織病料勻漿經5 000 g離心10 min后，取上清按照試劑盒說明書進行病毒DNA/RNA提取，取上述上清1.5 mL，11 000 g離心10 min后棄上清，保留離心管底沉淀物按照說明書進行細菌基因組DNA提取，所提取的核酸置于-80 ℃保存。

表1 引物和探針信息Table 1 Primers and probes information

1.2.3M.bovis、BAdV-7、BAdV-3、BRSV、IBRV、BEFV、BPIV3及多殺性巴氏桿菌的PCR檢測M.bovis套式PCR及BAdV-7、BAdV-3、BRSV、BEFV、BPIV3、多殺巴氏桿菌的PCR檢測方法均參考文獻[10-16]中的操作方法進行檢測。IBRV檢測采用美國Applied Biosystems(AB)公司的VetMAXTMIBR/BHV-1 Reagents商品化試劑盒進行，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 細菌的分離培養、鑒定及昆明小鼠致病性試驗 用接種針穿刺病死肉牛的內臟組織(肺臟、淋巴結、脾臟)病料及用接種環挑取氣管內分泌物，分別劃線接種于血清瓊脂平板，于37 ℃含有5% CO2培養箱內倒置培養72 h，每日觀察生長情況，如有菌落生長，挑取單個菌落進行純化培養，純化后進行革蘭染色，并進行生化試驗和藥敏試驗。細菌生化鑒定和藥敏試驗采用法國梅里埃生化鑒定試紙條ID 32GN和ATB VET。純化、鑒定出的菌株分別以9.8×108個CFU/只的接種量腹腔接種10只昆明小鼠作為試驗組，同時以同等劑量的無菌生理鹽水分別接種2只昆明小鼠作為對照組。飼養觀察7 d，每天觀察記錄小鼠的飲食欲和精神狀態，以及發病死亡情況。同時剖檢病死小鼠，觀察記錄其內臟組織器官病理變化，并進行接種菌株的回收試驗。

1.2.5M.bovis的分離培養及鑒定 用接種環穿刺病料中的肺臟組織及挑取氣管分泌物，分別劃線接種于支原體固體篩選培養基平板，置于37 ℃含5% CO2培養箱，培養3 d，每日觀察菌落生長情況。待菌落長出后挑取單個菌落，劃線于固體篩選培養基平板繼續進行純化培養。將牛支原體固體篩選培養基平板上長出的菌落置于光學顯微鏡下觀察其形態，并對菌落進行瑞氏染色鏡檢、生化鑒定、PCR鑒定和系列分析。牛支原體16S rRNA基因序列擴增25 μL PCR反應體系：2倍PCR預混液2×Plus Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物16S rRNA-MB1697-F、R(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O將反應體系補足為25 μL。反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min運行40個循環，72 ℃ 延伸10 min。擴增產物經1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增出目的條帶的PCR產物送至昆明碩擎生物科技有限公司進行測序，采用雙向測序法測通，將所得到的測序結果通過DNASTAR軟件進行校對、拼接，將拼接的結果在NCBI GenBank中進行BLAST比對，同時進行同源性和進化樹構建分析。

1.2.6M.bovis本動物回歸試驗 將分離到的牛支原體菌株液體培養物間隔7 d噴鼻感染2頭荷斯坦奶公牛，每次每頭牛噴鼻5 mL，連續噴鼻感染4次，同時在0、14 d和45 d行胸腔注射，每次5 mL，接種完后繼續飼養觀察2個月，每天早晚各測量體溫1次，并觀察牛只的精神狀態和飲食欲情況。同時采用無菌生理鹽水以同樣的方法噴鼻及胸腔注射接種2頭奶公牛作為陰性對照。接種感染試驗結束后采集試驗組及陰性對照組牛只血清樣品檢測牛支原體抗體轉陽情況。

2 結果

2.1M.bovis、BAdV-7、BAdV-3、BRSV、IBRV、BEFV、BPIV3及多殺性巴氏桿菌的PCR檢測 病死犢牛內臟組織(肺門淋巴、肺)和氣管分泌物樣品的BAdV-3、BRSV、BPIV3、IBRV及多殺性巴氏桿菌PCR檢測結果均為陰性。牛支原體巢式PCR外側引物M.bovis-net-P1、M.bovis-net-P2，內側引物M.bovis-net-P3、M.bovis-net-P4 PCR分別擴增出約1 912 bp和442 bp大小的特異性條帶。同時樣品還成功擴增出約775 bp大小的BAdV-7特異性目的條帶(圖1)。分別將上述PCR產物送測序公司測序，所得序列在NCBI GenBank中進行BLAST比對。結果顯示，所得BAdV-7特異目的片段序列與NCBI GenBank中的牛腺病毒7型(登錄號:X53989)蛋白酶基因同源性達99%(核苷酸同源性：784/749)。所得牛支原體特異目的片段序列與NCBI GenBank中的Ningxia-1株(登錄號:CP023663)、08M株(登錄號:CP019639)的同源性達到100%(核苷酸同源性：286/286)。

圖1 M.bovis和BAdV-7的PCR檢測結果Fig.1 PCR detection results of M.bovis and BAdV-7A：牛支原體引物M.bovis-net-P1、P2擴增結果(N： 陰性對照； P： 陽性對照； S1： 肺臟組織； S2：氣管分泌物； M： DNA Marker DL2 000); B：牛支原體引物M.bovis-net-P3、P4擴增結果(N： 陰性對照; P： 陽性對照; S1： 肺臟組織; S2： 氣管分泌物; M： DNA Marker DL2 000); C：牛腺病毒7型蛋白酶基因擴增結果(M： DNA Marker DL2 000； N： 陰性對照； S1： 肺臟組織； S2： 牛舌爛斑組織； S3： 氣管分泌物)A: PCR results of M.bovis-net-P1/P2 primers(N: Negative control; P: Positive control; S1: Lung tissue； S2: Trachea secretions； M: DNA Marker DL2 000); B: PCR results of M.bovis-net-P3/P4 primers(N: Negative control； P: Positive control； S1: Lung tissue； S2: Trachea secretions； M: DNA Marker DL2 000); C: PCR results of BAdV-7(M: DNA Marker DL2 000； N: Negative control； S1: Lung tissue； S2: Lesions of the tongue； S3: Trachea secretions)

2.2 細菌分離培養及鑒定

2.2.1 細菌分離培養 劃線接種肺臟和淋巴結樣品的血清瓊脂平板，置于37 ℃ 5% CO2培養箱培養24 h后，觀察到有2株菌落生長，2株菌株的菌落表面均光滑、濕潤，顏色均呈灰黃色但存在一定色差，革蘭染色形態觀察1株菌體較大(圖2A)，另1株菌體較小(圖2B)。分離到的2株菌革蘭染色均為革蘭陰性短桿菌(圖2)。

圖2 分離菌株革蘭染色結果(1 000×)Fig.2 Gram staining results of the isolated bacterial strains(1 000×)A：大菌落菌體形態； B：小菌落菌體形態A: Gram staining of the macrocolony; B: Gram staining of the microcolony

2.2.3 昆明小鼠致病性試驗 弗格森埃希菌和克呂沃爾菌屬菌株試驗組各有2只小鼠于接種36 h內發病死亡，其余8只小鼠在接種6 h后出現精神沉郁、食欲減退和擠堆現象，但72 h后逐漸康復。2個對照組的小鼠精神狀態、飲食欲均無異常表現。剖檢2只病死昆明小鼠，可觀察到心臟出血、肺臟充血出血，胃腸道充血出血及黏膜脫落，肝臟、腎臟及脾臟略微腫大。同時從心血及肝臟組織內回收培養出接種細菌。

2.3 牛支原體分離培養與鑒定

2.3.1 牛支原體分離培養 肉眼可觀察到培養基平板上有針尖大小、半透明菌落生長，菌落表面稍干燥、凸起、邊緣整齊呈圓形(圖3)。將菌落置于正置顯微鏡下放大觀察，可觀察到菌落形態為典型的“油煎蛋狀”(圖4)。

圖3 牛支原體分離培養菌落Fig.3 The colonies of M.bovis

圖4 牛支原體菌落形態(400×)Fig.4 The colonial morphology of M.bovis(400×)

2.3.2 牛支原體的生化鑒定 挑取支原體固體篩選培養基上純化培養的牛支原體菌落，接種于細菌微量生化反應管中，培養5 d后，結果顯示該菌株不分解葡萄糖、乳糖、甘露醇、精氨酸、二磷酶，不液化明膠，尿素酶陰性，符合牛支原體的基本生化特性，并將該牛支原體云南分離株命名為XDJY-YN-2017株。

2.3.3 牛支原體云南分離株XDJY-YN-2017株的PCR鑒定 刮取菌落提取細菌基因組DNA，用牛支原體引物M.bovis-net-P1、P2，P3、P4 進行套式PCR檢測，均擴增出特異目的條帶(圖5)。

圖5 支原體菌落巢式PCR檢測結果Fig.5 The nest-PCR results of theM.bovis colonies 1～4：引物M.bovis-net-P3、P4擴增結果; 5～8：引物 M.bovis-net-P1、P2擴增結果； M：DNA Marker DL2 000； 4、8：陰性對照; 1、5：陽性對照; 2、3、6、7：菌落樣品 1-4: PCR results with primers M.bovis-net-P3/P4; 5-8： PCR results with primersM.bovis-net-P1/P2; M： DNA Marker DL2 000; 4,8： Negative control; 1,5: Positive control; 2,3,6,7： Colonial samples

2.3.4 牛支原體16S rRNA基因序列PCR擴增 牛支原體云南分離株XDJY-YN-2017株經牛支原體16S rRNA基因序列引物PCR擴增，成功擴增出約1 697 bp大小的特異目的條帶(圖6)。

圖6 牛支原體16S rRNA基因序列PCR鑒定結果Fig.6 The PCR identification result for M.bovis 16S rRNA gene sequenceN：陰性對照; P：陽性對照; S1:氣管分泌物; S2:肺臟組織; M： DNA Marker DL2 000N: Negative control; P: Positive control; S1: Trachea secretions; S2: Lung; M： DNA Marker DL2 000

2.3.5 牛支原體16S rRNA基因序列分析及進化樹構建 牛支原體16S rRNA核苷酸序列比對分析結果顯示，云南分離株XDJY-YN-2017株與以色列2010年的72242株、中國2011年的Ningxia-1株、2010年的HB0801株、2009年的CQ-W70株、2008年的08M株同處于一個進化分支(圖7)，其16S rRNA序列的1 520個核苷酸完全一致，而模式菌株(Type strain)Donetta株單獨處于一個進化分支(圖7)。我國2008年的Hubei-1株和2012年的NM2012株同處于一個進化分支(圖7)。

所比對的13個菌株16S rRNA核苷酸序列的同源性結果顯示，云南分離株XDJY-YN-2017株與以色列2010年的72242株、中國2011年的Ningxia-1株、2010年的HB0801株、2009年的CQ-W70株、2008年的08M株的1 520個核苷酸完全一致，同源性為100%，而與其余菌株的同源性也均在99.7%以上(圖8)。Donetta株與其他菌株相比在第2核苷酸位置處有1個堿基A的缺失(圖9)。

圖7 系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree▲：牛支原體云南分離株XDJY-YN-2017株；下同 ▲：M.bovis strain XDJY-YN-2017. The same as below

圖8 16S rRNA核苷酸同源性Fig.8 16S rRNA nucleotide identity

圖9 16S rRNA核苷酸序列比對Fig.9 16S rRNA nucleotide sequence alignment

2.3.6 牛支原體動物回歸試驗 試驗過程中，試驗組及對照組牛只臨床均無發熱現象，也無咳喘等呼吸系統癥狀，飲食欲正常。最后1次人工感染2個月后，采集血清樣品檢測牛支原體抗體，結果顯示抗體均轉陽，而2頭陰性對照牛只的牛支原體抗體仍然保持陰性。

3 討論

牛支原體又稱為牛霉形體，是導致牛發生感染的主要病原之一，主要引起牛的呼吸系統疾病，肺臟損傷等，還可引起乳房炎、關節炎和結膜炎[9]。1961年Hale在美國首次從患乳腺炎的病牛牛乳中分離到牛支原體[10]，此后該病在多國均有報道，并給畜牧業造成重大經濟損失。2008年，石磊等首次在我國湖北從患病犢牛中分離到牛支原體[11]，隨后國內多地均有報道該病的發生和流行。牛支原體通過呼吸道飛沫傳播，也可通過接觸乳頭、生殖道分泌物或吮乳傳播，人工授精和配種也可導致該病的傳播、擴散。該病分為最急性型、急性型和慢性型。通常發病牛只精神沉郁，咳嗽，采食量下降，體溫升高至40～42 ℃，有膿性分泌物從眼鼻流出，呼吸頻率加快，表現為呼吸急促，呼吸困難，胸部聽診有簫笛樣啰音[12]。本試驗從病死犢牛肺臟組織病料及氣管黏性分泌物中檢測出牛支原體核酸陽性，并從上述2種病料中成功分離出牛支原體，提示牛支原體均大量存在于肺臟組織及氣管分泌物，并可通過呼吸系統分泌物向外擴散傳播。為了弄清楚XDJY-YN-2017株的致病性，本試驗還開展了本動物回歸試驗。因肉牛和奶牛對牛支原體最易感，本次試驗選用牛支原體抗體陰性的5月齡荷斯坦公犢牛作為試驗動物，結果顯示，噴鼻和胸腔注射能夠讓試驗犢牛的牛支原體抗體轉陽，但試驗期間未出現明顯的臨床癥狀，提示牛支原體為條件性致病性病原體。

牛腺病毒屬腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，國際病毒分類學委員會確認腺病毒有10個血清型，即BAdV-1～BAdV-10[13]，主要引起犢牛的肺炎和腸炎，其中BAdV-7的致病性最強，感染牛出現40 ℃以上的稽留熱、肺炎和嚴重下痢[4]。這10個血清型在不同的國家已被分離到[14]，目前，牛腺病毒已呈世界性分布，給很多國家造成嚴重的經濟損失。BAdV-7的原型株Fukuroi株在1768年被日本的Inabay等從發熱、腹瀉和氣喘的母牛血液中分離到[4]，在國外BAdV-7已被列為引起犢牛肺炎和腸炎重要病原之一[4]。BAdV-7的發病牛和隱性感染牛都是該病的傳染源，1～4周齡犢牛感染本病表現為結膜炎、肺炎、腸炎、腹瀉和多發性關節炎。病犢牛體溫升高，食欲減退或廢絕，呼吸加快。發病率達70%～80%，死亡率低，與其他病原混合感染時會加大死亡率。成年牛感染無臨床癥狀。本病主要經呼吸道和消化道感染，病毒在體內主要侵害血管，引起呼吸道和消化道為主的疾病。牛腺病毒在室溫可存活1～4個月，對干燥和凍融有抵抗力，對乙醚、氯仿、去氧膽酸鈉有抵抗力，可耐受pH 3～9，pH 2及以下病毒失活，70 ℃ 1 min可被滅活[15]。截止到2017年，我國還沒有關于牛腺病毒7型的分離報道，本試驗從有嚴重呼吸道癥狀的犢牛氣管分泌物和內臟組織(肺、淋巴結、脾)中檢測出腺病毒7型，說明該病毒在我國牛群是存在的。牛腺病毒7型在10個血清型中致病性最強，近年來，我國養牛業不斷發展，疾病傳播的可能性也不斷加大，所以必須要高度重視腺病毒7型對養牛業的危害，在育種時一定要優選優育，從國外或國內其他省份購買牛時，也要高度重視該病的流行及自然感染帶毒情況。本試驗雖然嘗試了牛腺病毒7型的分離、培養，但可能由于病料采集時機不佳，病料中活病毒含量太低或者病毒對培養細胞不夠敏感等原因，導致病毒分離培養失敗。

牛群一旦感染牛支原體后就很難被清除，感染牛支原體的病牛會長時間帶菌，并向外界環境排放支原體，感染牛支原體后牛的機體免疫力和抵抗力會急劇下降，容易增強繼發感染或混合感染的病原菌毒力[16]。國外報道，牛支原體易與溶血性巴氏桿菌、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒等發生混合感染，國內發病牛易與泰勒蟲發生混合感染，本試驗檢測出牛支原體與腺病毒7型混合感染，提示能與牛支原體混合感染的病原體還有很多。本試驗對云南部分地區的牛支原體血清抗體進行初步調查，無臨床癥狀的牛群中牛支原體血清抗體陽性率達9.52%，提示牛支原體在無臨床癥狀的牛群中還是存在的。很多感染牛支原體的牛只并未表現出明顯臨床癥狀，僅是偶爾咳嗽，飲食欲、精神狀態及體溫均正常，但牛支原體會破壞機體的免疫系統，攜帶牛支原體的牛群在應激狀態下很容易被其他病原攻破機體的免疫防線，造成疾病的發生。感染牛不斷向外界排放牛支原體，很多剛出生的犢牛就容易被感染，如果有其他應激原的存在或其他疫病侵襲，就會造成犢牛大規模發病，甚至發生死亡。雖然牛支原體致病力不強，但其在牛群中的危害不可小覷，當牛群中出現感染牛支原體的病牛時，應及時將其隔離，并做好消毒工作，防止擴散。此外，本試驗采集的5份尋甸病牛血清，牛支原體抗體檢測均為陽性，說明該養殖戶的病牛確實感染了牛支原體，且在長途運輸應激下，導致免疫力低下繼發感染牛腺病毒7型，最終導致了本次疫情的發生。

為了了解細菌致病及繼發感染情況，本試驗同時也開展了細菌的分離培養工作，成功分離、鑒定出弗格森埃希菌及克呂沃爾菌屬各1株。昆明小鼠的致病性試驗結果顯示，2株分離菌株具備較弱的致病力，推斷為繼發感染菌株。

隨著我國養牛業的不斷發展壯大，經常跨地區、跨國界引進牛群，這不僅會引入許多外來動物傳染病，同時由于長途運輸應激，牛群免疫力下降，更易發生常見牛傳染病的混合感染。有研究發現，牛支原體在混合感染的病原中起主導作用，長途運輸、環境條件和飼草飼料等應激因素的改變是牛支原體感染發病的誘因。該養殖戶從山東購進的犢牛大量發病死亡，推斷極有可能是牛群存在牛支原體及牛腺病毒7型的原發感染，加上長途運輸、氣候、飼養環境及飼草飼料改變等應激，牛群免疫力下降，最終導致混合感染多種病原體后發病死亡。所以，從異地引進牛群時，要重視牛群的健康狀況，在運輸及飼養過程中盡量減少應激，方能提高外購牛只的成活率。