分子育種技術在鮭鱒魚類抗病育種中的研究進展

劉 佳,盧玉婷,劉蕓娜,閆子豪,汪惠慶,李月紅

(吉林農業大學動物科學技術學院,吉林 長春 130118)

鮭鱒魚是國際公認的優質名貴魚，其肉質鮮美、具有較高的營養價值和保健價值。鮭鱒魚營養價值比一般淡水魚要高，含有一般淡水魚類所沒有或很少有的二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)，而膽固醇含量幾乎為零，是優質的蛋白攝入源。但近年來由于養殖密度增大、健康養殖意識缺乏等原因，使得良種選育研究滯后，養殖病害頻發。分子育種是綜合分子生物學、基因組學、生物統計學、生物信息學等理論和技術建立的一種綜合育種技術。

1 鮭鱒魚類抗病育種

魚類的抗病能力存在種間、種群間、種群內差異。例如，Silim等[1](1982年)發現不同來源的河鱒對傳染性肝胰腺壞死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的敏感性有顯著差異，死亡率差異范圍在30.9%～72.3%。在相同的條件下，虹鱒和湖鱒感染IPN的死亡率分別為6.5%～11.4%和1.5%～3.8%。由此可見，通過選擇育種的方法可以對魚類進行改良，以提高其對某些傳染病的抵抗能力。

常規的魚類育種選育策略是利用細菌或病毒對種群內的個體感染以篩選出抗病能力較強的個體留種選育[2]。這種方法雖然能夠取得一定的成功，但是卻也有很多弊端：(1)人為造成大量死亡，帶來經濟損失；(2)以死亡或者存活作為選擇標準帶來很多不利；(3)人為感染往往需要許多勞動力，操作過程繁瑣；(4)此種選擇方法世代間隔比較長；(5)此方法往往只能提高魚類對某些特定病原體的抵抗力[3]。

抗病品種的獲得一般要進行兩方面操作，一是通過遺傳操作技術獲得性狀變異的群體；二是通過在群體或家系中選擇固定目標性狀，使之具有優于原選育群體的生產性狀[4]。早期的育種研究基本上都是利用表型差異來進行優良性狀的選擇，由于環境因素的干擾和選擇強度的限制，表型選擇只對遺傳力較高的性狀有好的選擇效果，換句話說，遺傳力較低的性狀通過表型選擇難以獲得所希望的選育結果；另一方面，“雜交-回交”等基因漸滲育種技術無法檢測出遺傳上的優良個體，只有通過不斷地回交、測交等遺傳操作才能獲得優良品種，這需要相當多的代數才能完成選育過程[4]。

針對這些僅利用表型性狀進行選擇的不足之處，育種家們試圖利用遺傳標記輔助育種，但早期的遺傳標記，包括細胞學標記和蛋白質標記各自具有一些缺點，比如蛋白質標記有的需特殊顯色方法和技術，有的具有發育和組織特異性，有的僅反映編碼區表達信息，在育種中的應用受到限制[5]。近年來，國內外學者在水產生物全基因組測序和精細圖譜繪制上取得重大進展，獲得了海量的基因資源信息，利用分子標記的選擇育種技術也進入到了培育新品種的研究和應用階段。

2 鮭鱒魚類分子育種技術

魚類分子育種技術是將分子生物學技術應用于育種中，在分子水平上進行育種。通常包括分子標記輔助育種和遺傳修飾育種(轉基因育種、基因編輯)。以下介紹幾種鮭鱒魚類分子育種技術。

2.1 全基因組測序 近年來，國內外學者在水產養殖生物全基因組測序和精細圖譜繪制方面取得了很大進展。2011年Star等[6]首次完成大西洋鱈魚全基因組測序。大西洋鱈魚通過增加MHC I基因和Toll樣受體基因的數量來維持其正常的免疫功能，這一發現將幫助國內外學者更有針對性的開發研制疫苗，同時對大西洋鱈魚的疾病管理和抗病育種提供了新的思路[6]。2014年,Berthelot等[7]完成對虹鱒魚基因組測序，這是科學界首次發布鮭科魚類的完整基因組。這些序列將有助于開發更高效的抗病育種工具，更好地選擇出具有理想性狀的親魚。

2.2 重要抗病相關基因篩選 冷水性魚類抗病相關功能基因主要包括：主要組織相容性復合體(MHC)、天然抗性相關巨噬蛋白(Natural resistance associated macrophage protein,NRAMP)、抗菌肽 (Antimicrobial peptides,AMPs)等[8]。主要組織相容性復合物(MHC)是一類與疾病抗性相關的重要候選基因，表1 是一些鮭鱒魚類MHC基因的序列[9]。傳染性造血器官壞死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)對鮭鱒魚危害較大，陶麗竹等[10]調查發現，IHNV對紅鱒魚苗的致死率高達80%。研究表明：虹鱒MHC基因的差異導致它們在傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)病毒抗性和敏感性上存在差異[11]。天然抗性相關巨噬蛋白(NRAMP) 是生物體內的一種抑制胞內寄生菌侵染的免疫蛋白，能夠促進溶酶體與吞噬小體的融合，起到降解吞噬細胞吞入病原菌的作用，該蛋白的結構特征及作用功能成為一個新的研究熱點[8]。目前，在人和小鼠等哺乳動物中已發現2種天然抗性巨噬蛋白:NRAMP1和NRAMP2。NRAMP1基因通過轉運二價陽離子使病原體缺乏增殖生長所必需的離子，從而達到抵抗胞內微生物繁殖的作用，促使動物抵抗病原菌的侵染[12]。NRAMP2基因則廣泛表達于組織中，研究表明NRAMP2基因在縊蟶肝胰腺中參與了縊蟶的天然免疫過程[13]。AMPs是先天免疫系統的重要組成部分,被認為是機體免疫的第一道防線，對多種細菌、病毒等均具有抑制殺傷作用，還能降低促炎性趨化因子的表達，抑制過量炎癥反應和細菌產物(如磷壁酸)引起的內毒素釋放，避免組織損傷，對宿主起到保護作用[14-15]。抗菌肽對水產養殖常見的病原菌，如嗜水氣單胞菌、梅氏弧菌、遲鈍愛德華氏菌及溫和氣單胞菌均有較好的抑菌效果。

表1 冷水性魚類MHC基因序列

2.3 高密度遺傳連鎖圖譜繪制及QTL定位 第1代水產養殖動物的遺傳連鎖圖譜大多出現于20世紀 90年代后期，由于微衛星標記和Ⅰ型標記的數量還不夠，當時的圖譜多由微衛星標記、Ⅰ型標記、RAPD(Random amplified polymorphism DNA)標記和AFLP(Amplified fragment length polymorphism)等幾種標記組成，如Young等繪制的虹鱒圖譜[16]。目前水產養殖動物高密度遺傳連鎖圖譜的構建主要采用單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)標記進行，國外利用5 950個單核苷酸多態性標記構建了大西洋鮭高密度遺傳圖譜[17]，利用2 226個單核苷酸多態性標記構建了虹鱒高密度遺傳圖譜[18]。QTL(Quantitative trait locus)是控制數量性狀的基因在基因組中的位置，它以遺傳連鎖圖譜為基礎，檢測作圖群體中基因型和數量性狀的數值，通過連鎖分析確定QTL 在遺傳連鎖圖譜上的相對位置[19]。由于魚類的生長速度、肉質、抗病、飼料轉化率等重要經濟性狀受許多基因、環境因素相互作用的影響，所以，這就需要通過QTL定位來準確估計每個基因位點對性狀的貢獻率，從而減少環境方差的影響，提高選育的精確度，加快選育進程[19]。

2.4 抗病相關分子標記篩選與應用 微衛星標記是均勻分布在真核生物基因組中的簡單重復序列，由2～6個核苷酸的串聯重復片段組成[20]。近年來，國際上許多國家競相利用微衛星標記技術來改造傳統的水產養殖業，包括用于分子標記輔助選育、病害的分子診斷和品系的分子標識等[21]。自2000年以來，我國學者開始大規模地克隆主要水產養殖種類的微衛星標記。在抗病相關分子標記篩選方面，已經初步篩選出虹鱒抗細菌性冷水病(Coldwater disease,CWD)12個相關標記，與傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV) 相關的19個單核苷酸多態性標記[22]。

2.5 轉基因育種 魚類基因轉移研究自首次在金魚上獲得成功以來，全世界20多個國家的幾十個實驗室相繼開展了魚類基因轉移的研究[9,23]。近幾年隨著魚類功能基因組研究的發展，一些抗病相關功能基因如抗菌肽基因、干擾素基因等相繼被分離和克隆，為魚類抗病基因轉移提供了基因資源。加拿大學者Garth等[24]將一種冬鰈(Winterflounder)的抗凍蛋白基因導入大西洋鮭魚，使后者對低溫有了一定的抗性。

2.6 基因組編輯技術 基因組編輯技術是近幾年來發展起來的對基因組進行精確修飾的一種先進技術，主要包括轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和 CRISPR/Cas9兩項技術[25]。2014年，Edvardsen等[26]采用 CRISPR/Cas9 技術在大西洋鮭上敲除了2個與色素沉積相關的基因，酪氨酸酶(Tyrosinase)和溶質載體家族45成員2(slc45a2)，結果表明所有注射的胚胎中有40%和22%分別對slc45a2和Tyrosinase表現出高度的突變誘導；而在孵化時，這2個靶基因的突變頻率也是可見的，表現出從完全缺乏色素沉著到部分丟失和正常色素沉著的分級表型。從整個胚胎中分析80多個(slc45a2)序列克隆時，CRISPRslc45a2/Cas9注射的胚胎顯示出完全沒有色素沉著，或者只有少數色素斑點。這些表明CRISPR/Cas9可以在F0代中誘導雙等位基因敲除。

2.7 全基因組選擇技術 全基因組選擇(Genomic-wide selection,GS)也稱基因組選擇(Genomic selection,GS)，是指在全基因組范圍內通過基因組中大量的標記信息估計出個體全基因組范圍的育種值，并加以選擇的育種方法[27]。全基因組選擇不依賴于表型信息，能夠捕獲基因組中的全部變異，對于低遺傳力、難以度量的性狀提升效果明顯，可通過早期選擇縮短世代間隔[28]。阿米巴鰓病(Amoebic gill disease,AGD)是鮭魚養殖業面臨的最大威脅之一，Robledo等[29]對1 500條大西洋鮭進行了AGD感染，使用鰓損傷和阿米巴蟲量作為宿主抗性的指標特征，這2個特征都是可遺傳的，并且顯示高度正相關，表明它們可能是宿主對AGD抗性良好的測量指標。大西洋鮭感染AGD的結果表明，使用交叉驗證方法，基因組預測的準確性比使用系譜獲得的準確性高出18%，并且與基于系譜的方法相比，基因組選擇的使用可以加快選擇抗病性，且精確度更高[29]。

3 展望

鮭鱒魚類是優質的冷水魚類，養殖極為普遍。我國從20世紀50年代開始養殖虹鱒，主要集中在北方地區。隨著漁業生產技術的不斷發展，我國的鮭鱒魚類的養殖范圍也在不斷擴大，養殖品種也由單一的虹鱒擴大到金鱒、銀鮭、大西洋鮭等。但在養殖過程中鮭鱒魚常常因病害造成大批死亡，經濟損失較大。優良品種是養殖業持續發展的基礎，有關作物和家畜的分子育種理論、技術和研究報道較多，但是有關水產動物的還不多見。本文通過介紹分子育種技術在鮭鱒魚類抗病育種中的研究進展，闡述了分子育種技術在抗病育種中的重要性，旨在為水產動物抗病育種研究提供科學借鑒。