ANO1穩定轉染細胞模型的構建及生理特性

徐連秀,狄文慧,吳明達,劉雪瑩,王國慶,胡 江,郝 峰

(1.吉林醫藥學院檢驗學院,吉林 吉林 132013 ； 2. 延邊大學醫學院,吉林 延邊 133002； 3. 北華大學醫學技術學院,吉林 吉林 132013 ； 4. 吉林醫藥學院附屬醫院,吉林 吉林 132013)

鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一種能被Ca2+激活的，可轉運人體中含量最高的氯離子通道蛋白，其廣泛表達于血管平滑肌細胞、上皮細胞和心肌細胞等。研究表明，CaCCs在許多生理活動中扮演著重要角色[1]，如上皮細胞分泌、平滑肌細胞收縮、神經和心臟興奮性等。2008年3個研究小組發現陰離子通道1(Anoctamin 1, ANO1)是鈣激活氯離子通道的編碼基因，其與許多疾病的發生密切相關[2-4]。ANO1在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤細胞中高表達[5-7]；ANO1的表達和活性增加是肺動脈高壓血管收縮和重構的重要病理機制[8-9]；ANO1是多種惡性腫瘤、高血壓、哮喘、慢性阻塞性肺病和病毒性腹瀉等疾病的潛在靶點[10-13]。因此，ANO1一直以來都是科學家們研究的熱點，但是ANO1是否可以直接被Ca2+激活？是通過怎樣的途徑被激活？在激活狀態下電流是否隨時間推移發生變化？仍是亟待解決的問題。本試驗成功構建了真核表達載體，并構建了ANO1生理特性的模型，結合電生理技術驗證，系統性研究ANO1轉運陰離子、調節劑對ANO1的調控作用、ANO1電流受Ca2+的調控作用、ANO1的Run-down現象等生理特性。本試驗結果不僅可用于ANO1生理特性的研究，也為后續ANO1調節劑篩選、ANO1關鍵堿基和氨基酸的發現、ANO1與某些生理活動和病理機制的內在聯系等研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000脂質體、博萊霉素(Zeocin)和新霉素(G418)、卡西霉素(Calcimycin)、離子霉素(Ionomycin)、腺苷5′-三磷酸二鈉鹽(Adenosine 5′-triphosphate disodium salt, ATP)、5′-三磷酸鳥苷三鈉(Guanosine 5′-triphosphate trisodium salt, GTP)、碳酰膽堿(Carbamoylcholine chloride, Carbachol)和毒胡蘿卜素(Thapsigargin, TG)，均購自Invitrogen公司；尼氟滅酸(Niflumic acid, NFA)和5-硝基-2-苯酚丙胺苯甲酸鹽[5-nitro-2(3-phenylpropylamino) benzoate, NPPB]，購自Sigma公司；大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(Fischer rat thyroid, FRT)由本實驗室保存。

1.2 主要儀器 Fluo star多功能酶標儀(德國BMG)，膜片鉗(德國HEKA)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，流式細胞儀(美國BD)。

1.3 方法

1.3.1 細胞模型的構建

1.3.1.1 最適抗生素濃度的選擇 將狀態較好FRT鋪到96孔板中，16 h后細胞密度達到70%～90%，分別加入濃度為1 000、800、600、400、200 μg/L和100 μg/L的Zeocin，2周后細胞全部死亡的濃度即為Zeocin抗生素篩選的最適濃度。G418應用相同的方法選擇最適濃度。

1.3.1.2 構建共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的細胞株 按照Lipofectamine 2000說明書的步驟將ANO1轉入FRT細胞中，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，應用最適濃度的Zeocin抗生素篩選，倒置熒光顯微鏡下挑取細胞膜上可見綠色熒光的細胞，2次傳代培養后仍可表達則為穩定表達的細胞株。將YFP-H148Q/I152L轉入已表達ANO1的FRT細胞中，應用最適濃度G418抗生素篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下細胞膜和胞漿均可見綠色熒光的FRT細胞克隆，具體步驟同上，獲得共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞株。

1.3.1.3 流式細胞儀檢測細胞模型純度 將FRT細胞、FRT-ANO1細胞和FRT-ANO1-YFP-H148Q/I152L細胞分別消化，用PBS重懸，圈取細胞群設門P1，分別上樣10 000個細胞，選擇FL2通道，激發光波長488 nm，發射光波長575 nm。

1.3.2 熒光淬滅動力學試驗鑒定細胞模型的有效性 將試驗分為試驗組與對照組，鈣鎂PBS洗3遍，加入50 μL鈣鎂PBS，試驗組(共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞)：酶標儀加入120 μL含激活劑的碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態變化；對照組1(共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細胞)：酶標儀加入120 μL碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態變化；對照組2(僅表達YFP-H148Q/I152L的FRT細胞)：具體步驟與試驗組相同。酶標儀具體設置如下：發射光波長540 nm，激發光波長500 nm。速度為每秒檢測5個點，動態檢測相對熒光強度，其中前2 s為基線，2 s后以280 μL/s的速度向目標孔中加入碘化鈉PBS 120 μL。

1.3.3 ANO1轉運陰離子的特性 選取狀態較好的細胞，酶標儀加入120 μL含激活劑的碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態變化。

1.3.4 不同調節劑對ANO1的調控作用 向狀態良好的細胞中加入不同濃度的Ionomycin、Calcimycin、GTP、ATP、Carbachol、TG激活劑及NFA和NPPB抑制劑，加入120 μL碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態變化。應用Fluo-4法，檢測加入激活劑前及加入激活劑后的細胞內Ca2+濃度。

1.3.5 應用膜片鉗檢測Run-down現象 應用內面外向式(Inside-out)膜片鉗技術，將FRT細胞消化傳代到小玻片上，電極入水前給予正壓，入水時電極電阻3～5 MΩ，給負壓形成6 GΩ以上高阻封接，形成Inside-out記錄模式。鉗制電壓為-50 mV。在分別給予含0、0.6 μmol/L和1 μmol/L Ca2+溶液，檢測對ANO1的電流作用。全細胞(Whole-cell)膜片鉗技術，將狀態良好的轉染ANO1的FRT細胞接種到玻片上，電極入水后電阻為4～6 MΩ，給予負壓形成GΩ高阻抗封接后，快速給予負壓使電極尖端的細胞膜破裂，形成Whole-cell記錄模式。初始鉗制電壓為0 mV，記錄10 ms后，給予階梯式電壓刺激，電壓從-80 mV到+80 mV，每增加20 mV，各記錄800 ms，800 ms后電壓變為0 mV，繼續記錄100 ms。參考文獻[14]進行電極液配制。

1.4 統計學處理 ANO1對I-的轉運速度用相對熒光強度數值與時間變化曲線反映，相對熒光強度變化的初始速度乘以熒光強度的變化與I-轉運速度的常數0.002，即為ANO1對I-的轉運速度[15]。以SPSS 22.0軟件分析，組間比較用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結果

2.1 ANO1細胞模型 倒置熒光顯微鏡下觀察到ANO1表達在FRT細胞的細胞膜，YFP-H148Q/I152L表達在FRT細胞的胞漿(圖1)。流式細胞術結果顯示，ANO1穩定轉染效率大于90%(圖2B)，ANO1-YFP-H148Q/I152L共轉細胞系純度大于80%(圖2C)。以上結果說明共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L細胞模型構建成功。

圖1 ANO1細胞模型Fig.1 Cell model of ANO1A：ANO1表達在FRT細胞的細胞膜； B：YFP-H148Q/I152L表達在FRT細胞的胞漿A: ANO1 expression on FRT cell membrane; B: YFP-H148Q/I152L expression on FRT cell cytoplasm

圖2 流式細胞術檢測細胞模型的穩定轉染效率Fig.2 Detection of stable transfection efficiency of cell model by flow cytometryA：未經轉染的FRT細胞系； B：穩定轉染ANO1的FRT細胞系； C：共表達ANO1和YFP-H148Q/I152L FRT細胞系A: Untransfected FRT cell line; B: FRT cell line stably transfected with ANO1; C: Co-expressing ANO1 and YFP-H148Q/I152L FRT cell line

2.2 熒光淬滅動力學試驗鑒定細胞模型的有效性 結果顯示：試驗組加入含激活劑的碘化鈉PBS后，相對熒光強度顯著下降，提示ANO1蛋白通道開放，I-內流(圖3A)；對照組1中加入碘化鈉PBS后，檢測到相對熒光強度無顯著變化，提示ANO1蛋白通道不開放(圖3B)；對照組2中加入含激活劑的碘化鈉PBS后，相對熒光強度不發生變化，提示FRT細胞自身無ANO1蛋白的表達(圖3C)。試驗組碘離子轉運速度為(0.10±0.01)d[I]/dt mM/s，對照組(0.01±0.001)d[I]/dt mM/s，試驗組碘離子轉運速度顯著高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。上述結果表明，本試驗成功獲得了可用于研究ANO1生理特性的細胞模型。

圖3 熒光淬滅動力學試驗鑒定細胞模型的有效性Fig.3 Result of fluorescence quenching kinetics A:試驗組； B:對照組1； C:對照組2A: Experimental group; B: Control group 1; C: Control group 2

2.3 ANO1蛋白轉運陰離子的特性 加入含有激活劑的碘化鈉PBS后，熒光信號顯著下降，提示ANO1蛋白通道開放，I-內流(圖3A)。表明ANO1蛋白具有轉運陰離子的特性。

2.4 調節劑對ANO1蛋白的調控作用 加入Ionomycin、Calcimycin、GTP、ATP、Carbachol后，結果提示，激活劑對ANO1通道的開放起調控作用且呈劑量依賴關系，其半數最大活化作用的化合物濃度(Compound concentration of half-maximal activating efect, EC50)分別為7.52、12.75、69.94、145.60 μmol/L和490.60 μmol/L，Fluo-4檢測到Ca2+濃度迅速升高。加入TG熒光強度不發生變化(圖4A)，Fluo-4檢測到Ca2+濃度緩慢升高。加入抑制劑后，結果提示，抑制劑對ANO1的開放有抑制作用且呈劑量依賴關系，其半數最大抑制作用的化合物濃度(Compound concentration of half-maximal inhibitory efect, IC50)分別為35.75 μmol/L和102.40 μmol/L(圖4B)。表明ANO1調節劑對ANO1有調控作用且呈劑量依賴關系，迅速升高細胞內Ca2+濃度可以激活ANO1蛋白通道，緩慢升高細胞內Ca2+濃度不能激活ANO1蛋白通道。

2.5 膜片鉗檢測Run-down 應用Inside-out膜片鉗技術記錄到，在加入Ca2+溶液時有明顯的電流變化，加入無Ca2+溶液時無電流，加入1 μmol/L Ca2+溶液后，記錄到電流隨時間推移逐漸減小，出現明顯的Run-down現象，加入0.6 μmol/L Ca2+溶液時記錄到的電流明顯弱于加入1 μmol/L Ca2+時的電流，且記錄到的電流較穩定，不出現Run-down現象(圖5B1)。應用Whole-cell膜片鉗技術記錄到，初始電壓0 mV時和1 μmol/L游離Ca2+存在時，電流為0 mV，但隨著電壓的增加電流逐漸增大，即電流與電壓和時間呈正相關(圖5B1)。1 min后在相同的電壓條件下記錄到的電流明顯減小(圖5B2)，對圖5B1和圖5B2進行整理和分析得出電流與電壓的關系圖(I/V曲線圖)，曲線呈明顯的外向整流特性(圖5B3)。表明ANO1具有Run-down現象、時間、電壓和 Ca2+依賴性以及外向整流特性。ANO1是鈣依賴的氯離子通道，有Ca2+可以激活，無Ca2+則不激活，并且Ca2+可直接作用于ANO1。證實本試驗記錄的ANO1電流屬于經典的鈣激活氯離子電流，ANO1具有經典的鈣激活氯離子通道的生理特性。

圖4 ANO1激活劑及抑制劑的劑量依賴曲線Fig.4 Dose-dependent curve of ANO1 activator and inhibitorA：ANO1激活劑的劑量依賴曲線； B：ANO1抑制劑的劑量依賴曲線A: Dose-dependent curve of ANO1 activator; B: Dose-dependent curve of ANO1 inhibitor

圖5 膜片鉗記錄ANO1電流Fig.5 Patch clamp recorded ANO1 currentA：應用Inside-out膜片鉗技術記錄1 μmol/L和0.6 μmol/L Ca2+激活ANO1電流； B：應用Whole-cell膜片鉗 技術記錄1 μmol/L Ca2+激活ANO1的電流； B1：記錄初始時間的電流； B2：記錄1 min后的電流； B3：電流-電壓關系，曲線顯示典型的外向整流特征； B4：未轉染ANO1的FRT細胞電流記錄A: Application of inside-out patch clamp technology to record 1 μmol/L and 0.6 μmol/L Ca2+ activated ANO1 current; B: Applying the whole-cell patch clamp technology to record 0.6 μmol/L Ca2+ activated ANO1 current; B1: Recorded the current at the initial time; B2: Recorded the current after one minutes; B3: Current-voltage relationship, the curve showed typical outward rectification characteristics; B4: FRT cell current recording of ANO1 not transfected

3 討論

20世紀80年代，Barish于非洲爪蟾卵母細胞上首次記錄到鈣激活氯離子通道電流[16]，自此研究者開始對鈣激活氯離子通道進行探索。研究發現，ANO1是鈣激活氯離子通道的編碼基因，在跨上皮液體轉運和平滑肌細胞收縮等生理活動中發揮著重要作用[1]；其在腫瘤細胞中高表達，具有促進腫瘤細胞增殖和遷移的作用[5-7]，并且與高血壓[8-9]、囊性纖維化[10]等疾病的發生發展密切相關；研究驗證，抑制小腸上皮細胞中ANO1的表達能有效的減輕腹瀉[17]。ANO1在多種疾病中扮演著重要角色，因此，ANO1生理特性的研究是探索ANO1與其相關疾病關系必不可少的過程，在后續ANO1相關研究中發揮著重要作用。

本試驗驗證了ANO1與細胞內的Ca2+之間的調控關系，應用Whole-cell膜片鉗技術檢測到，加入高濃度Ca2+時，電流隨電壓增大而增大，具有經典的外向整流的特性，隨著時間的推移電信號明顯減弱，證明ANO1存在著Run-down現象。為了確保試驗結果的準確性，進一步應用Inside-out膜片鉗技術進行驗證，使通道脫離細胞環境，持續加入高濃度Ca2+，記錄到明顯Run-down現象，而當加入低濃度的Ca2+時，未記錄到Run-down現象。結果表明，ANO1中存在著Run-down現象且只有在高Ca2+時出現，低Ca2+時不出現。本試驗認為，Ca2+可直接作用于ANO1使其激活，Inside-out結果表明通道脫離細胞環境時仍記錄到電流變化，且無Ca2+條件下無電流變化，此結果表明，ANO1是鈣依賴的氯離子通道，在有Ca2+條件下可以被激活，無Ca2+不激活且Ca2+是直接作用于ANO1。而其是否還受到其他途徑的調控還有待研究。本試驗結果還表明，在0.6 μmol/L Ca2+存在下檢測到的結果較準確，記錄的電流較穩定，不隨時間變化，而在1 μmol/L Ca2+存在下，記錄到的電流隨時間推移逐漸減小即Run-down現象，基于此項結果，本試驗認為關于Ca2+激活的氯離子通道的相關研究應在低濃度Ca2+條件下進行，為后續Ca2+激活氯離子通道的相關研究提供了適宜Ca2+激活濃度。因此，本試驗成功構建了可用于研究的細胞模型，其具有操作簡單，經濟適用，特異性強，靈敏度高等優點。同時，為后續進行通道調節劑的篩選提供了更簡單、高效的篩選方法，以及進行高通量篩選等試驗打下了良好的基礎。

綜上，ANO1展示了經典的鈣激活氯離子通道特性。本試驗構建的細胞模型不僅可以應用于其生理特性的研究，也可用于小分子藥物的篩選，內環境調節等的研究，是醫學、分子生物學、細胞生物學等領域必不可少的研究過程。還為后續其他陰離子通道的研究及ANO1與某些生理活動和病理機制的內在聯系等研究提供了科學依據。