禽源大腸桿菌多重耐藥機(jī)制初探

楊躍飛,馬文杰,彭時龍,王鵬勇,王彥紅,孫懷昌

(1. 揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009 ； 2. 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室,江蘇 揚州 225009)

禽大腸桿菌病是由某些血清型致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)所致禽病的總稱，目前已成為危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一[1]。禽源大腸桿菌血清型非常復(fù)雜，有效疫苗研制困難，因此主要用抗菌藥物進(jìn)行防治。目前我國用于禽大腸桿菌病防治的藥物種類繁多，臨床使用也很不規(guī)范，這些抗菌藥物的濫用導(dǎo)致耐藥菌株不斷增加、耐藥譜不斷擴(kuò)大[2]。

大腸桿菌耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，多重耐藥主要與主動外排系統(tǒng)過量表達(dá)、菌體細(xì)胞膜通透性改變以及耐藥性質(zhì)粒傳播有關(guān)，其中藥物外輸作用是重要機(jī)制之一[3-4]。大腸桿菌的AcrAB-TolC外排系統(tǒng)是最主要的主動外排系統(tǒng)，其過量表達(dá)導(dǎo)致大腸桿菌對四環(huán)素、氯霉素、β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類等多種藥物產(chǎn)生耐受性[5-6]。soxS是一種多重耐藥調(diào)控基因，激活多重耐藥操縱子marRAB和acrAB等17個基因的表達(dá)，正向調(diào)控AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)水平,將細(xì)菌胞膜間的藥物排出菌體外，從而降低菌體內(nèi)的藥物含量，達(dá)到耐藥作用[7-9]。soxS基因不會因為動物來源不同發(fā)生同源性改變，但會由于抗菌素壓力，增加調(diào)控能力，目前在犬源、雞源和兔源大腸桿菌均已發(fā)現(xiàn)氨基酸序列發(fā)生改變，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)菌對藥物的耐受[10-12]。

使用氟喹諾酮類藥物防治動物大腸桿菌病較普遍，由于這類藥物的大量使用，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象也較嚴(yán)重，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因傳播也是重要的耐藥因素。參與氟喹諾酮耐藥質(zhì)粒攜帶的基因是qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac-(6′)-Ib-cr，質(zhì)粒攜帶的aac-(6′)-Ib-cr和qnrS單基因是導(dǎo)致氟喹諾酮類耐藥的常見機(jī)制[2，13]。

本試驗中獲得具有多重耐藥性的12株禽源大腸桿菌，對其氟喹諾酮類耐藥基因和soxS基因進(jìn)行檢測，并對soxS基因進(jìn)行測序分析，旨在進(jìn)一步闡明禽源大腸桿菌耐藥機(jī)制，為禽大腸桿菌病合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 禽源大腸桿菌分離自揚州大學(xué)動物醫(yī)院就診病禽病料，主要來源于揚州、鎮(zhèn)江、鹽城等地，病死家禽主要表現(xiàn)為心包炎、肝周炎等癥狀和病變。利用麥康凱培養(yǎng)基從12份病料分離獲得大腸桿菌12株，其中雞源大腸桿菌7株，鵝源大腸桿菌5株。

1.2 主要試劑 藥敏紙片購自杭州微生物有限公司，包括新霉素(NEO)、鏈霉素(STR)、丁胺卡那霉素(AMK)、諾氟沙星(NOR)、卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GEN)、美洛西林(MEZ)、左氧氟沙星(LVX)、多西環(huán)素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、妥布霉素(TOB)、復(fù)方新諾明(TMSZ)、多黏菌素B(POL B)、頭孢曲松鈉(CRO)和環(huán)丙沙星(CIP)；TaqDNA聚合酶等PCR試劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 藥敏試驗 用Kirby-Bauer藥敏紙片法進(jìn)行，無菌挑取麥康凱培養(yǎng)基上單菌落，均勻涂布麥康凱培養(yǎng)基，取藥敏紙片貼于瓊脂平板表面，37 ℃培養(yǎng)24 h測量抑菌圈直徑，參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)藥敏紙片擴(kuò)散法藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)[14]判定結(jié)果。

1.4 PCR引物合成 擴(kuò)增soxS基因的PCR引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)株K12株大腸桿菌(MG1655)soxS基因序列(GenBank:CP032667.1)設(shè)計，擴(kuò)增氟喹諾酮類耐藥基因PCR引物參考文獻(xiàn)[15-18]設(shè)計(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗使用的PCR引物Table 1 PCR primers used in the experiment

1.5 PCR擴(kuò)增 25 μL PCR 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.2 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水加至25 μL。擴(kuò)增soxS基因PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別切取目的條帶提取DNA，送往南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果用DNASTAR軟件進(jìn)行分析比對。擴(kuò)增耐藥基因的PCR程序參考文獻(xiàn)[15-18]進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗 結(jié)果顯示，12株禽源大腸桿菌對多西環(huán)素、氟苯尼考全部耐藥，其中11株對復(fù)方新諾明和美洛西林耐藥，對鏈霉素、卡那霉素、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、妥布霉素、左氧氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素和多黏菌素耐藥菌株分別為10、8、7、6、6、5、4、4、4、3株和2株。

2.2soxS基因擴(kuò)增與序列分析 PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，12株禽源大腸桿菌均攜帶soxS基因，部分PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果見圖1。將測定序列與K12株大腸桿菌soxS基因序列進(jìn)行對比分析，部分菌株soxS基因堿基發(fā)生變化。將分離株soxS基因序列推導(dǎo)成氨基酸序列，與K12株大腸桿菌soxS氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，5株發(fā)生氨基酸替換，其中4株第12位丙氨酸替換為絲氨酸(A12S)，1株第83位纈氨酸替換為異亮氨酸(V83I)(表2)。

圖1 大腸桿菌soxS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析Fig.1 Analysis of the PCR amplification products of E. coli soxS gene M：DNA maker； 1～4：PCR產(chǎn)物 M：DNA maker； 1-4：PCR product

表2 12株禽源大腸桿菌soxS氨基酸序列比對分析Table 2 Analysis of soxS amino acid sequence from 12 E. coli strains of avian origin

2.3 耐藥關(guān)系分析 在12株禽源大腸桿菌中，4株對10種以上抗菌藥物耐藥，6株對5～10種抗菌藥物耐藥，2株對5種以下抗菌藥物耐藥。根據(jù)soxS氨基酸序列，將12株大腸桿菌分為A12S、V83I和無突變組，其中3/4 A12S突變株、1/1 V83I突變株、2/7無突變株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和氟苯尼考耐藥。在檢測的5個喹諾酮類耐藥基因中，12株大腸桿菌有2株攜帶qnrS基因(表3)。

3 討論

本試驗對12株禽源大腸桿菌藥物敏感性進(jìn)行了測試，在測試的8類15種常用藥物中，分離菌至少有四重耐藥，最嚴(yán)重的對8類藥物全部耐藥，6株對喹諾酮類藥物耐藥，11株對磺胺類藥物耐藥，12株對四環(huán)素類藥物耐藥，與文獻(xiàn)報道[11-12，19]的結(jié)果基本相似，表明本地區(qū)禽源大腸桿菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，并與臨床用藥關(guān)系密切。因此，在禽大腸桿菌病防治時要合理用藥，不盲目濫用藥物。

PCR檢測結(jié)果顯示，所有12株多重耐藥大腸桿菌均攜帶多重耐藥調(diào)控基因soxS，此基因正向調(diào)控AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)水平，以達(dá)到多重耐藥功能，進(jìn)一步證明soxS基因與禽源大腸桿菌多重耐藥的關(guān)系更為密切[9]。在7株soxS基因未突變禽源大腸桿菌中，僅2株對環(huán)丙沙星和氟苯尼考耐藥。但在4株A12S突變大腸桿菌中，3株對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和諾氟沙星耐藥。已有研究[11]證明，soxS基因突變導(dǎo)致的第12位丙氨酸被絲氨酸替換可導(dǎo)致氟喹諾酮類耐藥性增強(qiáng)，主要是soxSA12S突變后表達(dá)水平升高，上調(diào)acrB基因表達(dá)，增強(qiáng)了AcrB外排泵過表達(dá)有功能，從而使細(xì)菌對氟喹諾酮類耐藥性增強(qiáng)[11]。除了soxS在第12位氨基酸發(fā)生A12S突變之外，本試驗中1株細(xì)菌發(fā)生V83I突變，其他文獻(xiàn)報道了犬源和雞源大腸桿菌在第102位氨基酸發(fā)生突變(Asp-Gly),雞源大腸桿菌在第101位氨基酸亦發(fā)生突變(Ser-Cys)[11]，兔源大腸桿菌在第52位氨基酸發(fā)生相同突變(Ala-Thr)[12]。這些突變可能增加細(xì)菌對某種抗菌藥物耐受性，仍需要進(jìn)一步探索。

表3 禽源大腸桿菌耐藥關(guān)系分析Table 3 Analysis on drug resistance in 12 E. coli strains of avian origin

本試驗的菌株除了通過soxS基因表達(dá)對喹諾酮類藥物耐藥外，有2株通過qnrS基因增強(qiáng)耐藥。在中國地區(qū)不同動物來源大腸桿菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因有所不同，劉曉強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，豬源大腸桿菌中qnrS是主要流行基因[20]；而Li等研究表明，aac-(6′)-Ib-cr是主要流行基因[21]；孔令超等研究結(jié)果表明，雞源大腸桿菌中qnrS是主要流行基因[22]。在我國動物來源大腸桿菌攜帶質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因主要是qnrS和aac-(6′)-Ib-cr，本試驗結(jié)果比較符合喹諾酮類耐藥基因流行現(xiàn)狀。