小鵝瘟病毒的分離鑒定及遺傳變異分析

江丹丹,林鋒強,2,程曉霞,2,朱小麗,2,王 劭,2,肖世峰,2, 董 慧,2,陳仕龍,2,陳少鶯,2

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013 ； 2. 福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心,福建 福州 350013)

小鵝瘟(Gosling plague，GP)是侵害雛鵝和雛番鴨的高度接觸性傳染病，病原為鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)。該病最早由我國學者方定一于1956年首次發(fā)現(xiàn)，并在1961年成功分離到其病毒[1]，隨后我國及世界各地相繼報道了小鵝瘟的發(fā)生[2-7]，直到 1978 年該病病原被確定為鵝細小病毒。該病的病變特征為小腸黏膜表層大片壞死、脫落與纖維性滲出物凝成栓塞物或假膜包裹在腸內(nèi)容物表面，堵塞腸腔形成“腸栓塞”[1]。該病一年四季均可發(fā)生，傳播速度快，發(fā)病率和死亡率高，是危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成重大損失[1-4]。我國上市推廣應用的商品化GPV疫苗及高免血清，有效控制了小鵝瘟的流行和蔓延，但仍有發(fā)病死亡的報道[5-8]。本試驗從臨床以腸栓塞為特征的病死雛鵝病料中分離到3株病毒，經(jīng)間接免疫熒光試驗(IFA)、膠乳凝集試驗(LPA)等免疫學方法和基因序列鑒定，確認分離毒為GPV經(jīng)典毒株。結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源及處理 2021年2月，福建省南平市3個未免疫小鵝瘟疫苗的養(yǎng)鵝場陸續(xù)出現(xiàn)疑似小鵝瘟疫病，5～9日齡的雛鵝突然發(fā)病，精神萎靡，離群獨處，縮頭，厭食，排稀糞，臨死前頭點地，死亡率45%～65%，剖檢可見腸道內(nèi)有不同程度的栓塞，無菌采集肝、脾、胰腺等組織，剪碎研磨，以Hanks液制成20%勻漿，凍融3次，10 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，供病毒分離用。

1.2 番鴨胚及細胞 番鴨胚購自非疫區(qū)，番鴨胚成纖維細胞(MDEF)按常規(guī)方法制備。

1.3 主要試劑 抗鵝細小病毒(GPV)單抗[10]和GPV單抗致敏膠乳診斷試劑[11]，均為福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒研究室研制；異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠IgG(FITC-IgG)，購自武漢博士德生物工程有限公司；EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞，均購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司；TaKaRaExTaq、DNA marker DL2 000、DL5 000、pMD18-T，均購自TaKaRa公司。

1.4 GPV全基因擴增引物 擴增GPV全基因引物如表1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 The information of primers

1.5 間接免疫熒光試驗(IFA) 取內(nèi)臟組織在冰凍切片機中切成6 μm的薄片，于冷丙酮中固定15 min后，自然晾干，加1∶100稀釋的抗GPV單克隆抗體(一抗)，并設以生理鹽水代替一抗的空白對照，37 ℃濕盒中作用30 min，生理鹽水沖洗5～6次，加按工作濃度稀釋的FITC-羊抗鼠IgG(二抗)，同上作用并沖洗后，以50% PBS甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察，以出現(xiàn)亮綠色特異性熒光病灶判定為陽性。

1.6 病毒分離 取1.1處理的勻漿上清經(jīng)尿囊腔接種11日齡番鴨胚各3枚，0.2 mL/枚，石蠟封孔后置37 ℃溫箱孵育，同時設不接毒對照組，每日照胚2次至7 d，棄去24 h內(nèi)的死胚，胚胎瀕死時置4 ℃冰箱4 h以上，解剖、觀察病變，收獲胚胎和胚液，-20 ℃凍存及傳代，并取少許胚液和胚心，分別進行LPA效價測定和胚心冰凍切片IFA檢測。

1.7 分離毒對MDEF的適應性試驗 取長成單層的MDEF細胞，棄去生長液，接種1.6含毒胚液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用Hanks液潤洗1遍，加足量培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時設不接毒對照組，每天觀察細胞病變至7 d，或當細胞出現(xiàn)病變達75%左右，置-20 ℃反復凍融3次，收獲細胞及上清，-20 ℃凍存及傳代。將收獲的細胞毒同步接種于MDEF 96孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，當細胞病變達到30%時，棄去培養(yǎng)液，每孔加100 μL甲醇(預置-20 ℃)，于4 ℃固定30 min，棄甲醇，用0.85%生理鹽水洗滌1次，甩干，按1.5方法加一抗和二抗進行IFA檢測。

1.8 膠乳凝集試驗(LPA) 將分離毒用0.85%生理鹽水做連續(xù)倍比稀釋，取不同稀釋度的混合液12 μL和6 μL GPV單抗致敏膠乳在潔凈的96孔細胞培養(yǎng)板的板蓋上混勻，于37 ℃水浴溫箱中靜置20 min，觀察凝集反應，同時設陽性對照、陰性對照及致敏膠乳對照。結(jié)果判定參照文獻[11]，以出現(xiàn)“+”以上凝集判定為陽性，以出現(xiàn)“+”凝集的最高稀釋度的倒數(shù)為分離毒凝集價。

1.9 全基因序列擴增及分析 取第3代尿囊液參照EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒的說明書提取病毒核酸，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的經(jīng)典GPV株全基因序列(DY16株，MH209633.1)，應用Oligo 6.0 生物軟件設計了4對引物，依照TaKaRaExTaq說明書進行全基因片段的擴增。PCR產(chǎn)物進行電泳后利用回收試劑盒回收純化，參照pMD18-T質(zhì)粒試劑盒說明書進行基因克隆，挑取陽性克隆菌送至鉑尚生物技術(上海)有限公司進行測序。應用LaserGene 7.1對獲得的序列進行拼接，運用MegAlign軟件對分離株的基因組序列進行分析，同時與國內(nèi)外多株GPV全基因序列進行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 病死鵝IFA檢測 3份病死雛鵝組織冰凍切片經(jīng)抗GPV單抗為一抗的IFA檢測顯示組織切片上出現(xiàn)特異性熒光病灶，且熒光強弱不一，分布不均(圖1)，其中脾臟亮度最強，隨后依次為腎臟、肝臟、胰腺和心臟。以生理鹽水為一抗的組織切片無熒光反應，結(jié)果為陰性。

圖1 病死雛鵝組織熒光檢測結(jié)果(200×)Fig.1 Fluorescence test of dead gosling tissue(200×) A：脾臟; B：腎臟; C：肝臟; D：胰腺; E：心臟; F：空白對照組A: Spleen; B: Kidney; C： Liver; D： Pancreas; E: Heart; F: Blank control group

2.2 病毒的分離 組織勻漿上清接種番鴨胚尿囊腔并盲傳3代，3份病料在盲傳過程中出現(xiàn)死亡，暫將分離毒株命名為GPV NP1、GPV NP2、GPV NP5。其中GPV NP5盲傳3代均出現(xiàn)死亡，隨著代次增加，死亡時間由6 d縮短至4 d；GPV NP1和GPV NP2均在盲傳第2代出現(xiàn)死亡(表2)；剖檢死胚可見胚體全身出血，而對照組番鴨胚未見異常(圖2)；死胚胚心切片的IFA檢測顯示呈GPV特異性亮綠色熒光陽性反應，而對照組胚心IFA呈陰性(圖3)。

表2 番鴨胚接種組織勻漿后的死亡時間和胚液LPA效價Table 2 The death time and LPA titer of muscovy duck embryo inoculated with tissue homogenates

圖2 病料接種番鴨胚胚體病變Fig.2 Lesions on infected muscovy duck embryoA： 正常番鴨胚對照; B： 接毒后4 d死亡番鴨胚病變A: Normal muscovy duck embryo control; B: Pathological changes of muscovy duck embryos that died 4 days after inoculation

2.3 LPA檢測 從表2可知，收獲的死胚尿囊液與GPV致敏膠乳可產(chǎn)生肉眼可見的特異性凝集顆粒，且隨著盲傳代次增加，其LPA效價也提高；而對照組尿囊液與GPV致敏膠乳無凝集反應。

2.4 MDEF適應性 取第3代尿囊液接種MDEF單層細胞培養(yǎng)并盲傳3代，均在第3代出現(xiàn)細胞病變，表現(xiàn)為細胞折光性增強、圓縮，隨后病變范圍擴大，細胞逐漸脫落拉網(wǎng)。經(jīng)IFA檢測，結(jié)果顯示在感染細胞核中的特異性亮綠色熒光為GPV陽性(圖4)，而對照組細胞無熒光反應為陰性。

2.5 分離株全基因序列特性分析

2.5.1 PCR擴增結(jié)果及進化樹分析 3株分離毒經(jīng)PCR擴增各獲得4個片段，各片段長度均與預期大小一致，經(jīng)基因測序鑒定后運用LaserGene 7.1軟件進行拼接，獲得分離株全基因序列：GPV NP1為5 045nt、 GPV NP2為5 045nt、GPV NP5為5 046nt。應用MegAlign軟件分析將11條GPV相應全基因序列制作系統(tǒng)進化樹(圖5)。從圖5可以看出，所比對的序列分為3個類群，3株分離株具有很高的同源性，與江蘇揚州分離株DY16和重慶分離株RC16有很近的親緣關系，而與鴨短喙矮小綜合征病毒株M15和SC16，及GPV弱毒疫苗株SYG61v親緣關系較遠。

圖3 死胚胚心切片IFA熒光病灶(200×)Fig.3 Fluorescent lesions in the heart of dead embryo (200×)A: 正常胚胚心; B: 感染死胚胚心A: Heart of normal embryo; B: Heart of dead embryo圖4 分離毒致MDEF單層細胞熒光病灶(200×)Fig.4 Fluorescent lesions of MDEF monolayer on cells infected by isolated viruses(200×)A: 正常細胞; B: 感染細胞A: Normal cells; B: Cells after infection

圖5 分離株全基因遺傳進化樹Fig.5 Whole gene phylogenetic of isolated viruses ▲： 本次試驗所得分離株 ▲: Isolates obtained in this experiment

2.5.2 核苷酸同源性分析 將分離株與在GenBank數(shù)據(jù)庫獲得的GPV序列進行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示，3株分離株與GPV各毒株全基因核苷酸同源性在92.8%～99.8%，進一步分析可見，與鵝源DY16、RC16株的同源性最高，達99.7%以上；與匈牙利B株、安徽強毒株Y的同源性較高，在96.8%～97.4%；與鴨短喙矮小綜合征病毒株M15株和SC16株，及GPV弱毒疫苗株SYG61v同源性低，在92.8%～94.3%。

3 討論

免疫熒光技術分為直接免疫熒光(FA)[12]和間接免疫熒光方法(IFA)，本試驗應用抗GPV特異性單抗介導的間接免疫熒光方法(IFA)，對送檢疑似小鵝瘟的病死雛鵝肝脾胰腎等組織進行IFA檢測，能快速準確診斷小鵝瘟病例。應用番鴨胚從IFA陽性組織樣品中分離到3株病毒，經(jīng)IFA、LPA、基因序列測定分析等鑒定確認分離毒為鵝細小病毒。疑似病料組織冰凍切片IFA檢測顯示，不同組織間特異性熒光強度不同，脾臟>腎>肝>胰>心，這與郭卉等[13]報道的肝臟>脾臟，潘玉民等[14]報道的腎>肝臟>胰腺>脾臟>心存在差異，可能與不同毒株特性、發(fā)病病程等有關。

GPV對體外細胞培養(yǎng)宿主專一性較強，鵝胚、番鴨胚及其原代細胞是分離和增殖病毒適宜的試驗宿主，初次分離病毒以無母源抗體的番鴨胚和鵝胚最為敏感，且兩者接種病毒后的死亡時間、胚體病變情況都大致相同。但番鴨胚或鵝胚中不應該存在抗GPV的母源抗體，否則病毒的復制將受影響[15-16]。本試驗將病料勻漿上清接種番鴨胚進行病毒分離，GPV NP1、GPV NP2在盲傳第 2代出現(xiàn)死亡，GPV NP5接種第1代即出現(xiàn)死亡，且隨傳代次數(shù)增加，死亡時間縮短至4 d左右，與死胚尿囊液的LPA結(jié)果基本吻合，說明3株分離毒對番鴨胚的致病力存在一定差異。收獲的尿囊液接種MDEF細胞先折光性增強、圓縮，后呈拉網(wǎng)狀直至裂解脫落，與文獻報道的致細胞病變基本一致[2，15，17]。感染MDEF的IFA結(jié)果顯示，特異性熒光主要集中在細胞核中，與文獻報道一致[13，22]。

鵝細小病毒不僅是危害雛鵝和雛番鴨的重要疫病[2，17]，隨著病毒重組或不斷變異，感染譜也不斷擴大。自2015年以來，我國半番鴨、櫻桃谷鴨群出現(xiàn)以短喙、舌外露、生長障礙等為臨床特征的新疫病(俗稱大舌病、短嘴矮小綜合征等)[18-23]，經(jīng)病毒分離鑒定確認其病原為新型鵝細小病毒株或變異株。對分離毒的基因測序發(fā)現(xiàn)，本試驗的3株分離毒與我國鵝源經(jīng)典GPV(如DY16、RC16株)具有相似的基因組結(jié)構(gòu)特征，同源性達99.7%以上，與匈牙利的B株同源性97%左右；與鴨短喙矮小綜合征病毒M15株和SC16株同源性92.8%～94.3%。這些結(jié)果也表明了鵝細小病毒在不斷變異和感染宿主譜不斷擴大的同時，我國雛鵝群感染的經(jīng)典GPV毒株至今仍然存在并流行。鵝細小病毒的變異程度不同，其導致的疫病型也不同，防控策略也有差異。因此，鵝細小病毒感染的復雜性和有效防控問題應引起水禽養(yǎng)殖業(yè)者和科研工作者的重視。