黃芪提取液對ALV-J在DF-1細胞內轉錄的影響

林漢卿,溫貴蘭,張喜懿,汪德生,龔新勇,程振濤

(1. 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025 ； 2. 思南縣動物疫病預防控制中心, 貴州 銅仁 565100 ； 3. 貴州大學大數據學院,貴州 貴陽 550025)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病肉瘤病毒群引起的以造血細胞惡性增生為主要特征的多種腫瘤性疾病的總稱[1]。J亞群禽白血病病毒(ALV-J)于1988年在英國肉雞中被首次分離，是禽白血病11個病毒亞群中致病力相對較強、流行范圍相對較廣的一個病毒亞群，可引起骨髓細胞瘤病或骨髓白血病，導致雞群產生免疫抑制、消瘦、產蛋量下降[2-3]。作為禽類的三大腫瘤病之一，禽白血病對家禽的危害不可小覷，尤其是與網狀內皮組織增生癥及馬立克病混合感染時，三者之間的協同作用使得毒力增加，破壞力更強，也更加難以控制[4]。禽白血病目前尚無廣泛應用的特效疫苗，因此尋找能有效控制禽白血病的藥物迫在眉睫。

中藥是我國傳統的醫療方式，作為天然產物，中藥的毒副作用小，且不易產生耐藥性，有抗病毒、抗腫瘤、增強免疫力等功效，是防治禽類疾病的重要手段。黃芪有補氣固表，利尿消腫，托毒生肌，增加免疫功能等功效，是從古至今最常用的中藥之一[5]。本試驗以J亞型禽白血病病毒為研究對象，用熒光定量PCR方法，從細胞水平探索黃芪對禽白血病病毒復制的影響，試驗結果可為禽白血病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及病毒 ALV-J病毒由揚州大學秦愛建教授惠贈；DF-1細胞由貴州福斯特生物技術有限公司惠贈。

1.2 藥品 中藥黃芪購自貴陽同濟大藥堂，前期已用水煎法制成黃芪提取液，并測得最大安全濃度為62.5 mg/mL。

1.3 試劑 大腸埃希菌DH5α、四季青新生牛血清，均購自上海碧云天生物技術有限公司；RNA提取試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，購自北京康為世紀有限公司；2×EsTaqMasterMix、pMD-18T、連接酶Solution I、DL2 000 Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購自生工生物工程有限公司；細胞培養瓶和12孔細胞培養板，均購自美國康寧公司；0.25%胰蛋白酶、F12 DMEM細胞培養液，均購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司；SYBR Green I熒光定量PCR反應試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 熒光定量PCR方法的建立

1.4.1.1 引物設計 采用Primer Premier 5.0軟件，參照ALV-J原型毒株(基因登錄號:Z45390)的gp37基因序列設計1對熒光定量PCR特異性引物(F：5′-CAAGACGTGGAAGGGATG-3′；R：5′-GCAATGCAAACAGTAGCG-3′)，預擴增長度為196 bp。18S rRNA內參引物(F：5′-GTTCAGCCACCCGAGATTGA-3′；R：5′-CCCATCACGAATGGGGTTCA-3′)為本實驗保存，預擴增長度為145 bp。

1.4.1.2 重組標準質粒的構建 將ALV-J接種于生長良好的DF-1細胞上，72 h后提取細胞RNA，以其cDNA為模板，用設計的gp37基因熒光引物和18S rRNA內參引物分別進行PCR擴增，PCR反應體系25 μL：cDNA 2 μL，2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定正確后，純化回收并連接到pMD-18T載體上，連接體系：目的片段 4 μL、pMD-18T 1 μL、Solution I 5 μL，于16 ℃連接過夜。與載體連接好后，將連接體系全部轉入大腸埃希菌DH5α中，于氨芐平板上過夜培養，挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定，體系同上。鑒定為陽性的質粒送出測序，將測序正確的陽性質粒分別命名為pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA。

1.4.1.3gp37與18S rRNA標準曲線的構建 對pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA標準質粒進行10倍 倍比稀釋，取10-2～10-7共5個稀釋度，每個稀釋度設3個平行，在熒光定量PCR儀上進行擴增，建立標準曲線。反應體系20 μL：SYBR Green I 熒光定量PCR酶 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.6 μL、ddH2O 6.8 μL。

1.4.2 熒光定量PCR方法檢測黃芪對ALV-J轉錄水平的影響

1.4.2.1 黃芪對ALV-J的直接滅活作用 前期已測得黃芪提取液的最大安全濃度(TC0)為62.5 mg/mL。將ALV-J病毒液和稀釋至最大安全濃度的黃芪提取液按1∶1的比例混合均勻，接種于DF-1細胞12孔板，接種3孔，每孔1 mL，此3孔為直接滅活組。另設3孔為病毒對照組，每孔加1 mL ALV-J病毒液。作用2 h后，用DMEM依次洗凈，換成細胞維持液，置于37 ℃溫箱培養72 h。同時設置3孔只加維持液的細胞對照組。72 h后提取各孔RNA進行熒光定量PCR檢測。

1.4.2.2 黃芪對ALV-J的預防作用 設置3孔作預防組，先用稀釋好的黃芪提取液作用于單層DF-1細胞，1 h后棄掉，用DMEM洗凈，換成同體積的ALV-J病毒液，作用1 h后洗凈，換成細胞維持液。同樣設置3孔只加ALV-J病毒液的病毒對照組，作用2 h后換成細胞維持液。同樣設置3孔細胞對照組。37 ℃培養72 h后提取RNA進行檢測。

1.4.2.3 黃芪對ALV-J的治療作用 設置3孔做治療組，先用ALV-J病毒液攻擊細胞，1 h后棄掉并洗凈，換成同體積的黃芪提取液，作用1 h后洗凈，換成細胞維持液。同樣設置病毒對照組和細胞對照組，72 h后提取RNA進行熒光定量PCR檢測。

1.4.3 統計分析 將熒光PCR檢測結果導出，用SPSS軟件進行分析差異。以細胞對照組作參照，通過2-ΔΔCt方法分別計算出病毒對照組與直接滅活組、預防組及治療組之間gp37基因轉錄水平的差異。

2 結果

2.1 熒光定量PCR方法的建立

2.1.1 標準質粒的構建 以接種ALV-J的DF-1細胞cDNA為模板，用設計的2對熒光引物分別進行PCR擴增，結果見圖1，分別擴增出了196 bp和145 bp左右的特異性條帶，與預期結果一致。將PCR產物連接轉化后送出測序，序列比對結果也與預期一致。

2.1.2 標準曲線的建立 以pMD-T-gp37和pMD-T-18SrRNA為標準品建立標準曲線，結果如圖2所示：2個質粒的熔解曲線均為單一峰型，所設引物的特異性較強；pMD-T-gp37標準曲線E=102.0%，R2= 0.999，pMD-T-18SrRNA標準曲線E=98.6%，R2=0.996，2對引物的擴增效率符合要求。綜合分析，本試驗所建熒光定量PCR方法具有一定的特異性，可用于下一步試驗。

圖1 gp37基因(A)與18S rRNA(B) PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified products of gp37 gene (A) and 18S rRNA (B)M： DNA標準分子量(DL2 000); 1、2: 細胞上清cDNAM: DNA Marker DL2 000; 1,2: Cell supernatant cDNA

圖2 18S rRNA和gp37基因的擴增曲線(A、B)、熔解曲線(C、D)和標準曲線(E、F)Fig.2 Amplification curves (A,B),melting curves (C,D) and standard curves (E,F) of 18S rRNA and gp37 gene

2.2 黃芪對ALV-J轉錄水平的影響

2.2.1 黃芪對ALV的直接滅活作用 用2-ΔΔCt方法計算各組間gp37基因轉錄水平的差異，結果見圖3，直接滅活組的gp37基因表達量顯著低于病毒對照組(P<0.05)，與細胞對照組無顯差異(P>0.05)。

圖3 黃芪對ALV-J的直接滅活作用Fig.3 Direct inactivation effect of Astragalus on ALV-J不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05;下圖同Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05.The same as below

2.2.2 黃芪對ALV的預防作用 結果見圖4，預防組gp37基因的表達顯著低于病毒對照組(P<0.05)，與細胞對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖4 黃芪對ALV-J的預防作用Fig.4 Preventive effect of Astragalus on ALV-J

2.2.3 黃芪對ALV的治療作用 先接種ALV-J病毒，再用黃芪治療，結果如圖5顯示，治療組gp37基因的表達量顯著低于病毒對照組(P<0.05)。相比直接滅活組和預防組，治療組與細胞對照組的差異較大。

圖5 黃芪對ALV-J的治療作用Fig.5 Therapeutic effect of Astragalus on ALV-J

3 討論

由于ALV-J不能導致細胞病變，需借助熒光定量PCR等方法觀察病毒的生長、繁殖情況，故本試驗首先建立了ALV-J的熒光定量PCR檢測方法，便于后續研究。ALV為單股正鏈RNA，其編碼區主要有gag、pol和env三個結構基因。gag和pol基因保守性強，各亞群間的同源性在96%～98%，而ALV-J的env基因與其他亞群的同源性僅有40%左右，因此針對ALV-J的研究，常選擇env基因作為研究對象。env蛋白由表面糖蛋白亞單位gp85(SU)和跨膜糖蛋白亞單位gp37(TM)組成[6]。gp85基因常被用來鑒定ALV亞群，但因其具有高度的變異性，故不適宜用作設計熒光引物。gp37蛋白在病毒與細胞的融合中起到了非常關鍵的作用，當表面蛋白gp85與宿主細胞結合后，gp37的構象會發生改變，同時暴露出融合肽，融合肽作用于細胞膜，促成病毒粒子與細胞的融合[7-8]。gp37蛋白內部存在許多高度保守的序列，這些序列可能是抗病毒的重要靶點[9]。本試驗以ALV-J標準毒株ADOL-7501的gp37基因序列為參照，設計了1對熒光定量PCR引物，經驗證其特異性較強，擴增效率較高，可廣泛應用于ALV-J的研究。

黃芪又稱綿芪，味甘性溫，有補氣升陽、托毒排膿、利水消腫、斂汗固脫、托瘡生肌的功效，被稱為“補藥之長”[10]。黃芪的主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖及黃酮類化合物，還含有氨基酸和硒、錳、鋅、銅、鐵、鈣等微量元素[11]。已有大量研究證明，黃芪在抗病毒、抗腫瘤方面有明顯作用，其作用機制可能包括抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移、減少自由基生成、逆轉耐藥性等[12-13]。本試驗分預防、治療、直接滅活3個組，將ALV-J和黃芪藥液先后或同時作用于DF-1細胞，用熒光定量PCR方法檢測ALV-J的轉錄情況，發現黃芪能明顯下調ALV-J的gp37基因的表達。3個組相比，預防組與細胞對照組差異最小，直接滅活組次之，治療組差異最大，提示黃芪用于預防時效果最好，用于治療時效果相對較差。試驗結果進一步證明了黃芪的抗腫瘤作用，說明黃芪對禽白血病病毒復制有明顯影響，但產生作用的具體成分以及黃芪在動物水平抗ALV-J的效果仍有待研究。