不同光照周期對母兔同期發(fā)情和褪黑激素分泌的影響

王文利, 張玉仙,白欣潔,陳耀星,王子旭,董玉蘭

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系,北京 房山102442 ； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193)

褪黑激素是一種高度脂溶性激素，廣泛分布于植物、單細(xì)胞生物、無脊椎動(dòng)物以及脊椎動(dòng)物[1-2]。褪黑激素的分泌受到光照的強(qiáng)烈抑制，與黑暗的長度呈正相關(guān)[3]，因此血漿中褪黑激素的峰值及持續(xù)時(shí)間與每天日照時(shí)長(光照周期)呈負(fù)相關(guān)。光周期信號(hào)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為褪黑激素的化學(xué)信號(hào)[4]，通過褪黑激素動(dòng)物能夠感受光周期的變化，從而能隨一年的天氣變化有效地調(diào)控多種生理過程。季節(jié)性繁殖的動(dòng)物受到一個(gè)重要的環(huán)境因子影響——光照周期[5]，有研究顯示，嚙齒類和綿羊等季節(jié)性繁殖動(dòng)物的繁殖行為與褪黑激素的分泌量相關(guān)[6]。短日照以及黑暗條件下，禽類的性腺發(fā)育受到顯著抑制，外源性褪黑激素可以使羔羊提前5周左右性成熟[7]。敘利亞倉鼠是長日照動(dòng)物,處于短光周期下性腺萎縮、血液性激素水平下降，性活動(dòng)明顯受到抑制,給長光周期下飼養(yǎng)的敘利亞倉鼠注射外源的褪黑激素后，其繁殖活性受到抑制[8-9]。并且松果體摘除后的嚙齒類動(dòng)物性腺及血漿中卵泡刺激素和催乳素幾乎不再隨光照信號(hào)改變，而注射褪黑激素能夠抵消松果體摘除的影響[10]。上述研究結(jié)果提示，褪黑激素在光周期調(diào)控季節(jié)性繁殖動(dòng)物性腺活動(dòng)的過程中起到了十分重要的作用。

當(dāng)前，人們生活日益富足，綠色食品越來越受到歡迎，而光照刺激操作簡便、造價(jià)低廉，能夠避免藥物殘留問題、符合動(dòng)物福利，因此在家兔養(yǎng)殖的生產(chǎn)實(shí)踐中合理使用人工光照，對提高家兔生產(chǎn)性能、產(chǎn)品質(zhì)量，改變傳統(tǒng)的飼養(yǎng)模式具有十分重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。本試驗(yàn)旨在揭示褪黑激素在光照周期調(diào)控下對母兔同期發(fā)情的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 未經(jīng)產(chǎn)的健康的5月齡新西蘭母兔由長沙市某生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為scxk(湘)2014—0010]提供。48只母兔隨機(jī)分成長光照組(16-h L/8-h D)、短光照組(8-h L/16-h D)和對照組(12-h L/12-h D)共3個(gè)組，每組16只，單籠飼養(yǎng)，每排放4個(gè)兔籠，共4層，試驗(yàn)期為16 d。舍內(nèi)采用人工光照及人工控溫，飼養(yǎng)溫度維持在(24±2) ℃，自由采食和飲水。

1.2 光源與光照制度 本試驗(yàn)采用的光源為白光(400～700 nm)發(fā)光二極管(LED)。光照制度前期采用12-h L/12-h D，飼養(yǎng)10 d后，長光照組轉(zhuǎn)換為16-h L/8-h D，短光照組轉(zhuǎn)換為8-h L/16-h D，對照組保持12-h L/12-h D不變。光源照射到兔眼部的平均光照強(qiáng)度為(80±5) Lx，使用MS6610照度計(jì)(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)測量試驗(yàn)動(dòng)物房間光照覆蓋面符合試驗(yàn)要求的平均光照強(qiáng)度。飼養(yǎng)至16 d統(tǒng)計(jì)發(fā)情母兔只數(shù)，計(jì)算發(fā)情率并取材。試驗(yàn)動(dòng)物處理遵循北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院和中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)規(guī)定。

1.3 主要儀器設(shè)備 超低溫冰箱(Thermo，美國)；移液器(Eppendorf，德國)；酶標(biāo)儀(550，BLO-RAD，美國)；高速冷凍離心機(jī)(5810R，Eppendorf，德國)；微型離心機(jī)(mini-6K，杭州奧盛，中國)。

1.4 主要試劑 褪黑激素ELISA試劑盒(CEA908 Ge，武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，中國)；0.9%生理鹽水；肝素鈉(0.05 g肝素鈉溶于5 mL 0.9%生理鹽水)。

1.5 取材 于轉(zhuǎn)換光照后第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)情率，并分別在各組黑暗的第4個(gè)小時(shí)進(jìn)行兔子心臟采血。用75%酒精消毒，左手食指、中指及無名指并攏并在第3、4根肋骨附近輕觸兔左胸壁，緩慢移動(dòng)，在心跳最強(qiáng)烈處停下，右手持10 mL注射器(已吸入0.2 mL肝素)，將針頭稍傾斜沿中指刺入胸腔，有血液回流時(shí)停止刺入并開始抽血，抽取血液8 mL。采血完成后，立即轉(zhuǎn)入4 ℃，靜置6 h后，將上清分裝于潔凈的500 μL EP管中，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測指標(biāo)和方法

1.6.1 計(jì)算發(fā)情率 于轉(zhuǎn)換光照后第7天統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組母兔發(fā)情只數(shù)，然后計(jì)算發(fā)情率。

1.6.2 血清中褪黑激素含量測定 血清中褪黑激素濃度采用競爭抑制酶聯(lián)免疫試劑盒測定。原理：微孔板中包被褪黑激素單克隆抗體制成固相載體，同時(shí)加入生物素標(biāo)記的抗原和被測抗原后溫育，使兩者與特異性抗體競爭性結(jié)合。溫育后洗滌多余的抗原后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，溫育后洗凈加入顯色液。顯色液在辣根過氧化物酶的催化下顯現(xiàn)出藍(lán)色，加入酸后轉(zhuǎn)為黃色。顯色的深淺與樣品中的待測物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。褪黑激素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法見表1。

表1 褪黑激素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法Table 1 Standard dilution for melatonin

測定：用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各孔的光密度(OD值)。該試劑盒的檢測范圍是12.35～1 000 pg/mL；批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別小于10%和12%。血漿中褪黑激素含量用pg/mL表示。每個(gè)樣品重復(fù)3次。試劑盒由武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司提供。

1.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同光照周期下母兔的發(fā)情率 母兔發(fā)情時(shí)，外陰黏膜由蒼白轉(zhuǎn)為紅色或紫色、腫脹，分泌黏液。結(jié)果如表2所示，經(jīng)10 d(12-h L/12-h D)的人工光照后，轉(zhuǎn)換為1周的長光照組(16-h L/8-h D)、短光照組(8-h L/16-h D)和對照組(12-h L/12-h D)的人工光照后，長光照組的發(fā)情率最高，短光照組發(fā)情率最低，長光照組、短光照組和對照組母兔發(fā)情的比例分別為81.25%、12.50%和31.25%。

表2 光周期對雌兔發(fā)情率的影響Table 2 Effect of photoperiod on the ratio of estrus

2.2 血漿中褪黑激素的濃度 不同光照周期下血清中褪黑激素含量如表3所示，3個(gè)組的母兔在12-h L/12-h D的光周期下飼養(yǎng)10 d后，轉(zhuǎn)換光照制度1周后，長光照組、短光照組和對照組血漿中褪黑激素的濃度分別為(115.14±10.52)、(220.65±16.87) pg/mL和(176.50±15.03) pg/mL，長光照組血清褪黑激素水平比對照組顯著低34.80%(P<0.01)、比短光照組顯著低47.80%(P<0.01)，短光照組血清褪黑激素水平比對照組高25.00%(P<0.05)。

表3 光周期對血漿褪黑激素水平的影響Table 3 Effect of photoperiod on plasma melatonin level

3 討論

在長期的演化過程中，動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)生理活動(dòng)會(huì)隨著日照長短、溫度、濕度和食物等環(huán)境因子的改變而發(fā)生改變[11]，致使行為、內(nèi)分泌與生理代謝活動(dòng)等能夠與季節(jié)的改變相同步，從而適應(yīng)環(huán)境的變化實(shí)現(xiàn)種群的穩(wěn)定與延續(xù)，此過程稱為季節(jié)性光周期現(xiàn)象。

兔子雖不是嚴(yán)格的季節(jié)性繁殖動(dòng)物，雄性野兔的季節(jié)性繁殖行為同樣主要受到光周期的調(diào)控，同時(shí)人工增加光照時(shí)間能夠提高雌性野兔的性活躍度以及繁殖性能[11-12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長光照組、短光照組和對照組的發(fā)情率分別為81.25%、12.50%和31.25%，光照周期影響母兔發(fā)情的效果明顯，與Quintela等[11]、Mousa-Balabel等[12]、譚衛(wèi)國等[13]、王琦[14]的結(jié)果一致，從12-h L/12-h D的光周期轉(zhuǎn)換至長光周期下飼養(yǎng)1周后發(fā)情率顯著升高，而在短光周期下飼養(yǎng)1周發(fā)情率顯著下降。結(jié)果表明光周期能夠影響母兔的繁殖活動(dòng)。

日照時(shí)間長短(光周期)在季節(jié)性光周期現(xiàn)象中發(fā)揮了主要作用[15]。視網(wǎng)膜接收光周期的信息后轉(zhuǎn)換成神經(jīng)信號(hào)經(jīng)視神經(jīng)傳達(dá)至下丘腦，再經(jīng)由經(jīng)前神經(jīng)節(jié)最終轉(zhuǎn)換為松果體合成的褪黑激素夜間分泌的峰值和持續(xù)時(shí)間的化學(xué)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)光周期對水貂、綿羊、山羊和兔子等多種哺乳動(dòng)物更換被毛、生殖、體重、免疫系統(tǒng)、甲狀腺活動(dòng)、體溫調(diào)節(jié)、腫瘤的增殖以及更多的一般生理節(jié)律的調(diào)控[16]。松果體不能儲(chǔ)存褪黑激素，褪黑激素合成后立即進(jìn)入血液循環(huán)并迅速進(jìn)入各種組織和體液，因而血清中褪黑激素的濃度能夠時(shí)時(shí)反映出松果體的活性[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，長光照組、短光照組和對照組血清中褪黑激素的濃度分別為(115.14±10.52)、(220.65±16.87) pg/mL和(176.50±15.03) pg/mL，長光照組血清中褪黑激素水平比對照組顯著低34.8%(P<0.01)、比短光照組顯著低47.8%(P<0.01)，短光照組血清中褪黑激素水平比對照組高25.0%(P<0.05)。結(jié)果表明血清中褪黑激素水平與雌性新西蘭白兔的性腺活躍度呈負(fù)相關(guān)，與繁殖期處于長日照時(shí)期的季節(jié)性繁殖動(dòng)物如敘利亞倉鼠、黑線倉鼠等動(dòng)物的現(xiàn)象相似，但與繁殖期處于短日照時(shí)期的季節(jié)性繁殖動(dòng)物如綿羊等相反[19-22]。

綜上，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光照周期能明顯影響新西蘭白兔的發(fā)情狀態(tài)，長光周期能有效誘導(dǎo)新西蘭白兔同期發(fā)情，短光周期則明顯抑制新西蘭白兔發(fā)情，母兔血清中褪黑激素的水平顯著受到光照周期的影響，隨光照周期的變化而變化，并且與發(fā)情率呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果說明光照周期能顯著影響母兔的發(fā)情率和血清中褪黑激素的水平，由此可見褪黑激素介導(dǎo)了光周期調(diào)控母兔發(fā)情，具體如何進(jìn)行調(diào)控的還需進(jìn)一步研究。