柔嫩艾美耳球蟲gam22基因重組質粒的免疫原性及保護效果

董 青,王京森,李 新,王曉岑,李建華

(1. 吉林大學動物醫學學院,吉林 長春 130062 ； 2. 河南牧業經濟學院動物醫藥學院,河南 鄭州 450011)

雞球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)的球蟲寄生于雞腸道引起腸道炎癥、便血和產蛋率下降的寄生蟲病[1]，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)的致病力最強[2-3]。免疫預防是防控柔嫩艾美耳球蟲病的重要手段，其中基因工程疫苗是當前研究的重要內容之一。目前已報道的柔嫩艾美耳球蟲保護性抗原有蟲體表面抗原(如Et3-1E和EtSAG4[4]等)、微線蛋白(如EtMIC2和EtMIC3等)、棒狀體蛋白(如EtROP5和EtRON2等)以及配子體抗原(Etgam22[5]和Etgam59等)等。曹李琴[6]成功擴增出柔嫩艾美耳球蟲配子體Etgam22基因，該基因的開放性閱讀框大小為597 bp，編碼198個氨基酸，蛋白大小約為22 kDa，通過生物信息學分析發現該基因編碼區存在4個抗原決定簇，且該蛋白具有無規則卷曲、轉角區域、折疊等二級結構，預示此蛋白免疫原性良好。目前使用的雞球蟲保護性抗原表達系統有原核表達、真核表達和甲病毒復制子載體等，細菌、病毒以及改造后的雞球蟲也可作為疫苗載體。甲病毒構建的重組質粒具有高效表達目的基因、引起Th1型細胞免疫反應、在胞漿中表達目的蛋白之后便引發凋亡而被機體清理、安全性好等優點，已用于弓形蟲、瘧原蟲、柔嫩艾美耳球蟲疫苗的研究。本試驗選用Etgam22基因，構建pSMART2b-Etgam22重組質粒并表達該蛋白，通過動物試驗檢測其誘導雞體免疫應答和抗柔嫩艾美耳球蟲保護效果。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡海蘭褐雛雞，購自長春市農業科學院，飼養在無球蟲環境中。

1.2 材料 柔嫩艾美耳球蟲由本實驗室保存，定期傳代復壯；甲病毒復制子載體pSMART2b和293T細胞保存于本實驗室；DH5α感受態細胞、質?？焖傩√嵩噭┖?，均購自天根生化科技(北京)有限公司；Percoll，購自GE公司；DL2 000 Marker、DL15 000 Marker、DNA膠回收試劑盒、反轉錄相關試劑、BamH Ⅰ和ClaⅠ限制性內切酶、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等，均購自TaKaRa公司；RIPA裂解液，購自碧云天生物科技有限公司；無內毒素質粒小提試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；ClonExpressII?One Step Cloning Kit，購自諾唯贊生物科技股份有限公司；雞抗柔嫩艾美耳球蟲陽性血清為本實驗室前期制備；胎牛血清和DMEM培養基，均購自BI公司；IL-2和IFN-γ 細胞因子ELISA試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 柔嫩艾美耳球蟲配子體收集

1.3.1 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊的收集 從4 ℃冰箱中取出保存在2.5%重鉻酸鉀溶液中的孢子化卵囊，1 500 g離心10 min，棄掉上清，重復上述步驟3次；在沉淀中加入10% NaClO溶液，4 ℃中存放20 min殺菌，離心取沉淀加入PBS溶液，重復上述步驟3次，用一定體積PBS重懸蟲體備用。

1.3.2 雞柔嫩艾美耳球蟲配子體的分離和純化 配制SAC(1L)溶液(NaCl 9.85 g；CaCl20.55 g；葡萄糖 1.8 g；BSA 1 mg/mL；PMSF 0.17 g；Tris 1.21 g；透明質酸酶 0.5 mg/mL)備用。將1日齡雛雞飼養在無球蟲污染的環境中，于21日齡時接種1×104個孢子化卵囊，約132 h后剖殺雞只收集盲腸，剖開盲腸后用4 ℃預冷的SAC溶液沖洗腸道，刮取腸黏膜并浸入SAC溶液中，于37 ℃恒溫搖床消化1.5 h。然后分別用60目銅篩、260目網篩和17 μm孔徑的濾膜過濾去除組織碎片。將收集的濾液于3 500 g離心15 min，用PBS重懸蟲體，重復洗滌離心2次[7]。用PBS重懸蟲體并加入紅細胞裂解液，然后加入Percoll制成含有配子體的30% Percoll懸液，總體積為5 mL；取1支10 mL離心管，先向管底加入2 mL 50% Percoll分離液，再將含有配子體的30% Percoll懸液置于上層，3 500 g 水平離心10 min；將所得配子體沉淀用PBS反復洗滌5次，收集配子體沉淀保存于-20 ℃。

1.4 引物設計與合成 從NCBI數據庫中獲取柔嫩艾美耳球蟲Etgam22基因序列(GenBank:KY887585.1)，利用Oligo 7設計擴增目的片段的引物，根據諾唯贊ClonExpressII?One Step Cloning Kit說明書，在上、下游引物的5′端加入與插入載體兩端同源的序列(方框內序列)，便于用無縫克隆技術連接目的片段與載體。引物由吉林庫美生物公司合成，其序列為：上游引物(Forward primer)：GCGTGGGTCTGGATCGGATCCGATGAGGACTATCCTAGCCACCC(BamH Ⅰ);下游引物(Reverse primer)：CGGGCCCTAGGATGCATCGATGTTGATGTCGGTAAGCTGCTCTT(ClaⅠ)。

1.5 Etgam22基因的PCR擴增 采用TRIzol法提取柔嫩艾美耳球蟲配子體總RNA，取2 μg 總RNA用于反轉錄成cDNA，先加入Oligo(dT)引物1 μL，用H2O 補齊至總體積13 μL，65 ℃ 5 min，然后迅速冰浴2 min；再向上述體系中加入M-MLV 1 μL，RRI 1 μL，dNTP 1 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，于PCR儀中進行反轉錄42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min，4 ℃保存。以獲得的cDNA為模板，按照如下反應體系(50 μL)擴增Etgam22基因：5×Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，PrimeSTAR GXL Enzymes 1 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 31 μL。將PCR擴增程序設置如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 40 s，共34個循環；68 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產物用于凝膠電泳檢測，并用膠回收試劑盒回收目的片段。

1.6 重組質粒pSMART2b-Etgam22的構建 用限制性內切酶BamHⅠ和ClaⅠ對pSMART2b載體進行雙酶切，膠回收線性化pSMART2b。按照ClonExpressII?One Step Cloning Kit說明書，以無縫克隆方式將Etgam22基因與線性化pSMART2b載體進行連接。然后將重組產物轉化至DH5α感受態細胞。篩選陽性單克隆菌落后，將培養獲得的菌液提取質粒并進行PCR鑒定。委托吉林庫美生物公司對鑒定陽性的質粒進行測序，對序列正確的菌種進行保種。

1.7 重組質粒pSMART2b-Etgam22的蛋白表達鑒定 利用無內毒素質粒提取試劑盒提取pSMART2b-Etgam22重組質粒和pSMART2b空載體，用脂質體法將兩種載體分別轉染至293T細胞，同時設置293T細胞空白對照。轉染24 h后用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。SDS-PAGE電泳后進行Western Blot，用雞抗柔嫩艾美耳球蟲陽性血清作為一抗，對pSMART2b-Etgam22融合蛋白進行免疫反應性分析。

1.8 雛雞抗體水平以及IFN-γ和IL-2細胞因子的檢測 選取7日齡雛雞隨機分為3組，分別為白對照組(陰性對照)、紅對照組(未免疫感染組)和pSMART2b-Etgam22免疫組。將pSMART2b-Etgam22以30 μg的劑量在7、14日齡和21日齡免疫雛雞。分別在未免疫前以及一免、二免、三免后7 d采血、收集血清，ELISA法檢測Etgam22抗體水平，利用商品化ELISA試劑盒檢測雞IFN-γ和IL-2分泌水平。

1.9 抗球蟲免疫保護效果評價 在28日齡時對紅對照組、pSMART2b-Etgam22免疫組的每羽雞接種1×104個柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊。觀察死亡情況，攻蟲1周后稱重并剖殺，檢測體重變化、卵囊數量、盲腸病變，計算存活率、增重率、卵囊值、盲腸病變計分，計算抗球蟲指數(Anticoccidial index,ACI)=(存活率+相對增重率)-(卵囊值+病變值)，分析其保護作用。

2 結果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲gam22基因的克隆與重組質粒pSMART2b-Etgam22的構建 對PCR擴增獲得的產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了1條長度約597 bp的目的條帶，與Etgam22基因的預期片段大小一致(圖1A)。用無縫克隆技術連接的pSMART2b-Etgam22重組產物轉化至DH5α感受態細胞，對篩選到的陽性菌液提取重組質粒，經瓊脂糖凝膠電泳分析，得到了1條大小約13 035 bp的目的條帶(圖1B)。將重組質粒進行PCR鑒定，經瓊脂糖凝膠電泳可觀察到1條約597 bp的目的條帶(圖1C)。對PCR鑒定陽性的質粒進行測序，經BLAST分析發現載體上連接的目的條帶與GenBank中柔嫩艾美耳球蟲gam22基因序列(KY887585.1)的同源性為100%，說明重組質粒pSMART2b-Etgam22構建成功。

圖1 柔嫩艾美耳球蟲Etgam 22基因的克隆與重組質粒pSMART2b-Etgam22構建Fig. 1 Cloning of E.tenella gam 22 gene and construction of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22A：Etgam22的PCR擴增(M： DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：Etgam22基因PCR產物)； B：pSMART2b-Etgam22的構建(M： DL-15 000 DNA相對分子質量標準； 1：重組質粒pSMART2b-Etgam22)； C：Etgam22的PCR鑒定(M： DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：重組質粒pSMART2b-Etgam22的PCR鑒定)A：PCR amplification of Etgam22； B：Construction of pSMART2b-Etgam22； C：PCR identification of Etgam22

2.2 pSMART2b-Etgam22蛋白表達分析 收取細胞蛋白進行SDS-PAGE電泳,發現重組質粒pSMART2b-Etgam22轉染細胞樣品約在57kDa位置處有特異條帶，空載pSMART2b本身表達的蛋白約35kDa，而在57kDa處無條帶，說明目的基因在293T細胞中得到了表達(圖2A)。進行Western Blot分析，與293T細胞蛋白(Negative control)和轉染pSMART2b的293T細胞蛋白(pSMART2b)相比，pSMART2b-Etgam22轉染組細胞蛋白可在約57 kDa處觀察到1條被抗柔嫩艾美耳球蟲陽性血清識別的單一條帶(圖2B)，與該融合蛋白的理論大小一致，說明pSMART2b-Etgam22融合蛋白成功表達，且具有良好的免疫反應性。

圖2 pSMART2b-Etgam22轉染293T細胞后表達蛋白的分析Fig. 2 Analysis of the protein expression by pSMART2b-Etgam22 after transfection into 293T cellsA：考馬斯亮藍染色； B：Western BlotA：Coomassie brilliant blue staining； B：Western Blot (M：蛋白Marker； 1：pSMART2b-Etgam22； 2：pSMART2b； 3：293T細胞)

2.3 雛雞抗體水平和細胞因子水平檢測 每次免疫和攻蟲前心臟采血收集血清，用ELISA法檢測雞體的抗體水平。結果顯示免疫前與一免后pSMART2b-Etgam22組與白對照組相比抗體水平差異不顯著(P>0.05)，在二免和三免后隨著免疫次數的增加，pSMART2b-Etgam22組的抗體水平與白對照組相比顯著升高(P<0.01)(圖3)。

圖3 雞血清中抗體水平變化Fig.3 The changing antibody levels in chicken serum**：差異完全顯著，P<0.01；ns：差異不顯著，P>0.05；下圖同 **：Difference was completely significant，P<0.01； ns：No significant difference，P>0.05. The same as below

ELISA試劑盒檢測雞只IFN-γ和IL-2水平變化，結果顯示，在免疫前與一免后pSMART2b-Etgam22組與白對照組相比IFN-γ和IL-2水平差異不顯著(P>0.05)，隨著免疫次數的增加，pSMART2b-Etgam22組免疫雞只的IFN-γ和IL-2水平與白對照組相比升高顯著(P<0.01)(圖4、圖5)。

圖4 雞血清中IFN-γ含量Fig. 4 The quantity of IFN-γ in chicken serum

圖5 雞血清中IL-2含量Fig. 5 The quantity of IL-2 in chicken serum

2.4 抗柔嫩艾美耳球蟲的保護效果評價 與紅對照組相比，pSMART2b-Etgam22免疫組增重明顯(P<0.01)，卵囊排出量顯著降低，卵囊數量減少率為68.05%，盲腸病變計分降低(表1)，死亡率降低，相對增重率增高，病變值和卵囊值變低(表2)。綜合評價pSMART2b-Etgam22免疫組的抗球蟲指數為165(表2)，顯示良好的抗柔嫩艾美耳球蟲免疫保護效果。

表1 重組質粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球蟲保護效果Table 1 The protective efficacy of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 against E. tenella challenge infection

表2 重組質粒pSMART2b-Etgam22抗柔嫩艾美耳球蟲指數(ACI)Table 2 Anticoccidial index of recombinant plasmid pSMART2b-Etgam22 after E. tenella challenge infection

3 討論

巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaixma)的配子體滅活抗原(主要為Emgam56、Emgam230和Emgam82)是商品化亞單位疫苗CoxAbic的主要抗原成分，該疫苗能顯著降低毒害艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的卵囊排出量[9]。目前雞球蟲配子體抗原研究較少，只有少數幾種被發現并用于疫苗研究，如柔嫩艾美耳球蟲Etgam56、Etgam59和Etgam22，毒害艾美耳球蟲Engam22，堆型艾美爾球蟲Eagam56，巨型艾美耳球蟲Emgam56、Emgam82和Emgam230。這些抗原在這3種艾美耳球蟲中同源且有許多共同點，都具有較好的免疫保護原性[10]。張艷[11]選用巨型艾美耳球蟲Emgam56基因制備DNA疫苗pcDNA-Emgam56，該疫苗能使感染雞只體重相對增重89.7%，卵囊排出量減少53.7%，說明Emgam56具有較好的免疫原性，可對免疫雞只提供較好的免疫保護效果。劉悅等[12]發現柔嫩艾美耳球蟲配子體Etgam56具有較好的抗原性和交叉性，可分別被柔嫩艾美耳球蟲雞康復血清和毒害艾美耳球蟲雞康復血清識別。Stefanie等[13]發現鼠源Etgam56單克隆抗體腹腔接種感染柔嫩艾美耳球蟲的雞只后，可使卵囊減少率為78%，對該抗體識別的抗原決定部位(Etgam56的N端部分)進行原核表達，制備的重組蛋白疫苗不能為雞只提供有效的免疫保護，這可能與抗原的構象有關。朱玉蘭[14]對柔嫩艾美耳球蟲Etgam59進行原核表達，制備重組蛋白疫苗進行保護性研究，結果發現免疫組卵囊減少率為58.9%，該疫苗具有一定保護效果。堆型艾美耳球蟲重組蛋白rEagam56和rEagam82及兩者的聯合免疫均能給雞只提供一定免疫保護，疫苗組的ACI分別為148.24、143.92和148.74。

與gam56和gam82相似，gam22參與形成毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲等球蟲的卵囊壁，具有成為免疫保護性抗原的潛力[15-16]。曹李琴[6]用原核表達系統表達柔嫩艾美耳球蟲配子體Etgam22蛋白，制備疫苗后進行動物試驗，柔嫩艾美耳球蟲的卵囊減少率為23.83%。Rafiqi等[5]同樣利用原核表達系統表達柔嫩艾美耳球蟲Etgam22蛋白，以Montanide ISA 71 VG為佐劑制備重組蛋白疫苗，動物試驗表明該疫苗可使每克糞便卵囊數減少68.5%，總卵囊減少率為45.23%。用毒害艾美耳球蟲重組配子體蛋白rEngam22與rEngam59聯合免疫雞只，發現免疫后的感染雞只相對增重率為97.02%，卵囊減少率為41.93%[17]。本試驗采用的pSMART2b是基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)改造的DNA載體，具有高效率的真核表達調控元件等，如啟動子人巨噬細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)[18]。鄧瑤等[19]比較了與傳統 DNA 疫苗載體pcDNA3.1在轉染和蛋白表達效率方面的不同，結果發現在同等劑量以及同等情況下轉染細胞后，基于甲病毒衍生的載體表達量是 pcDNA3.1 載體的3倍左右，這表明了基于甲病毒衍生的復制型載體在基因工程苗應用方面的優勢。目前甲病毒復制子載體在寄生蟲 DNA疫苗方面的應用還較少。朱剛[20]選擇甲病毒復制子載體和弓形蟲表面膜蛋白 SAG3構建重組質粒pSMART2b-SAG3，分3次免疫小鼠并做攻蟲試驗。結果證明pSMART2b-SAG3可使免疫組小鼠存活率升高，對照組小鼠全部死亡，說明重組質粒對小鼠抗弓形蟲感染可以產生一定的保護力。在雞球蟲疫苗方面，祝濤[21]構建了重組質粒 pSMART2b-Rhomboid3并制備疫苗免疫雛雞，該疫苗的ACI 達到 184.22。本試驗利用甲病毒表達系統來表達抗原基因Etgam22，結果顯示將pSMART2b-Etgam22免疫雛雞后可成功誘導雞體產生免疫應答，動物試驗表明柔嫩艾美耳球蟲卵囊排出量減少，減少率為68.05%，其抗球蟲指數為165，具有一定抗球蟲保護效果。提示該表達系統在雞球蟲疫苗研制中具有較好的應用潛力,在后續的工作中需要對免疫劑量、使用佐劑和免疫程序等方面進行優化，為進一步制備雞球蟲疫苗提供了科學依據。