非洲豬瘟病毒CD2v蛋白的生物信息學(xué)分析及多表位疫苗的設(shè)計(jì)

田盼盼,秦曉東,宋金星,萬(wàn) 博,韓 悅,姬鵬超, 杜永坤,蔣大偉,吳亞楠,張改平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450002)

ASFV的結(jié)構(gòu)和免疫逃避的機(jī)制復(fù)雜、基因組龐大，且遺傳多樣性，嚴(yán)重阻礙了ASFV疫苗的研發(fā)，對(duì)于非洲豬瘟的防控來(lái)說(shuō)造成了困難。研發(fā)針對(duì)ASFV的有效疫苗刻不容緩，但是目前尚無(wú)可用于臨床生產(chǎn)的疫苗。多表位疫苗是一種新型的疫苗，其安全性較高，并且有很強(qiáng)的誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的能力，在抗腫瘤免疫、抗感染免疫、免疫逃避中都具有良好的應(yīng)用前景[6]。本試驗(yàn)利用各種生物信息學(xué)方法對(duì)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并且篩選出優(yōu)勢(shì)B、T淋巴細(xì)胞抗原表位，將其與通用Th細(xì)胞表位通過(guò)Linker串聯(lián)起來(lái)[7]，并連接到pET28a表達(dá)載體上，完成了多表位疫苗的設(shè)計(jì)，以期獲得有理想免疫原性的疫苗。從生物信息學(xué)層面為CD2v蛋白的功能研究以及ASFV的疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)GenBank檢索獲得非洲豬瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白氨基酸序列，由360個(gè)氨基酸(aa)組成。GenBank序列號(hào)為FR682468.1。

1.2 方法

1.2.1 CD2v蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy中的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)[8]分析該蛋白的分子質(zhì)量、原子數(shù)、氨基酸等電點(diǎn)、氨基酸結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和疏水性等理化性質(zhì)。

1.2.2 CD2v蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 利用Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)CD2v蛋白的信號(hào)肽[8]。使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)CD2v蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)[9]。

1.2.3 CD2v蛋白的抗原決定簇預(yù)測(cè) Predicting antigenic peptides(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預(yù)測(cè)CD2v蛋白的抗原決定簇[8]。

2010年七夕情人節(jié)那天，兩人的聊天記錄長(zhǎng)達(dá)十八頁(yè)。李輝嗟嘆：“我改變不了她，怎么辦？她完全不是我想象的樣子……”吳霞也很失落地說(shuō)：“每次情人節(jié)、女人節(jié)、圣誕節(jié)、結(jié)婚紀(jì)念日，我都好像和自己心愛(ài)的人一起過(guò)，可江帆大多數(shù)時(shí)候都拋下我，陪客戶(hù)應(yīng)酬。到底是錢(qián)重要，還是我重要？江帆也不禁汗顏：“我對(duì)妻子實(shí)在呵護(hù)不夠，她出軌我有責(zé)任。”

1.2.4 CD2v蛋白的抗原性預(yù)測(cè) 利用VaxiJenV(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)預(yù)測(cè)CD2v蛋白的免疫原性[9]。根據(jù)≥0.5的抗原評(píng)分對(duì)具有抗原性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分選(該模型的閾值為0.5)。

1.2.5 CD2v蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[7]和DNASTAR軟件預(yù)測(cè)CD2v蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[7]。

1.2.6 CD2v蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)CD2v蛋白的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)[8]。

1.2.7 CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 利用ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)，預(yù)測(cè)B淋巴細(xì)胞表位[9]。

1.2.8 CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)T淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) T淋巴細(xì)胞表位應(yīng)該包括兩種：CD8+T細(xì)胞識(shí)別的CTL表位和CD4+T細(xì)胞識(shí)別的HTL表位。利用NetCTL(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)以豬SLA-I類(lèi)分子預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)CTL淋巴細(xì)胞表位[9-10]。而輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)表位則選擇通用Th表位[11]。

1.2.9 多表位重組蛋白的設(shè)計(jì)及其多表位疫苗的構(gòu)建 根據(jù)抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果，選取優(yōu)勢(shì)抗原位點(diǎn)，按照一定的順序并用合適的Linker串聯(lián)得到重組蛋白。利用ExPAsy預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)，VaxiJenV預(yù)測(cè)其免疫原性，AllerTop(http://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/)預(yù)測(cè)致敏性[9]。將重組蛋白利用在線工具JCAT(http://www.jcat.de/)將其反向翻譯為DNA序列，并優(yōu)化其密碼子。最后在兩端加入酶切位點(diǎn)，選擇合適的載體構(gòu)建多表位疫苗[9]。

2 結(jié)果

2.1 CD2v蛋白理化性質(zhì)分析 ExPASy預(yù)測(cè)CD2v蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白分子質(zhì)量為41 008.89Da；含有22個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸，24個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸；理論等電點(diǎn)為6.21，在中性環(huán)境中帶負(fù)電；原子數(shù)為5 749，原子組成為C1868H2858N460O548S15，不穩(wěn)定系數(shù)為47.78，閾值為40，平均親水系數(shù)為-0.209，是不穩(wěn)定性親水蛋白。

2.2 CD2v蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) Signal P的分析結(jié)果顯示，CD2v蛋白有信號(hào)肽，為分泌型蛋白(圖1A)，TMHMM服務(wù)器的分析結(jié)果顯示，CD2v蛋白是一個(gè)膜蛋白，1～206 aa(粉色部分)位于膜外區(qū)；207～209 aa(紅色部分)在跨膜區(qū)；230～360 aa(藍(lán)色部分)在膜內(nèi)區(qū)(圖1B)；綜合跨膜區(qū)的分析結(jié)構(gòu)，說(shuō)明CD2v蛋白的確是跨膜蛋白。

2.3 CD2v的抗原決定簇預(yù)測(cè) Predicting antigenic peptides的分析結(jié)果顯示，該蛋白的平均抗原傾向是1.032 3，具有很好的抗原性，共有11個(gè)抗原決定簇，所在區(qū)域分別是4～20 aa、22～29 aa、62～73 aa、78～84 aa、91～100 aa、103～112 aa、118～128 aa、185～231 aa、267～278 aa、281～288 aa和291～356 aa。

圖1 CD2v蛋白信號(hào)肽(A)和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(B)Fig.1 CD2v protein signal peptide (A) and transmembrane structure prediction(B)

2.4 CD2v蛋白的抗原性預(yù)測(cè) VaxiJenV預(yù)測(cè)CD2v蛋白的抗原指數(shù)為0.523 1，閾值為0.5，說(shuō)明CD2v蛋白有抗原性。

2.5 CD2v蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) SOPMA分析：CD2v蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示，該蛋白由62個(gè)aa組成α螺旋，占總氨基酸的17.22%，99個(gè)aa構(gòu)成延長(zhǎng)鏈，占總氨基酸的27.50%，19個(gè)aa構(gòu)成β轉(zhuǎn)角，占總氨基酸的5.28%，180個(gè)aa構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲，占總氨基酸的50.00%。見(jiàn)圖2。

圖2 SOPMA預(yù)測(cè)氨基酸位點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Amino acid site and secondary structures predicted by SOPMAc：無(wú)規(guī)則卷曲； h：α-螺旋； e：延伸鏈； t：β-轉(zhuǎn)角c:Random coil; h:α-helix; e:Extended chains; t:β-turn

DNASTAR分析：結(jié)果見(jiàn)圖3，使用Gramier-Robson，Kyte-Doolittle，Jameson-wolf，Karplus-Schulz和Emini方法，通過(guò)綜合分析，抗原表位可能在31～38、49～54、57～62、66～70、77～80、86～92、113～114、130～135、151～152、159～167、178～181、183～185、196～197、231～236、242～249、254～259、263～268、299～320、329～332和327～333氨基酸區(qū)段。

圖3 DNASTAR Protean預(yù)測(cè)CD2v蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of CD2v protein predicted by DNASTAR Protean

2.6 CD2v蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 Phyre 2服務(wù)器根據(jù)同源建模的方法預(yù)測(cè)構(gòu)建CD2v蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖4)。

圖4 Phyre 2預(yù)測(cè)CD2v蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of CD2v protein predicted by Phyre 2

2.7 CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)B淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 利用ABCpred預(yù)測(cè)的B細(xì)胞抗原表位為303～319、297～313、152～168、309～325、258～274、237～252、282～298、69～85、57～73、25～31、13～29和175～191氨基酸區(qū)段。根據(jù)抗原決定簇位點(diǎn)以及預(yù)測(cè)的CD2v蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為參數(shù)，綜合篩選出的優(yōu)勢(shì)B淋巴細(xì)胞表位見(jiàn)表1。

2.8 CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè) NetCTL網(wǎng)站選取了分值較高的表位為150～159、142～151、279～288、83～92、271～280、87～96和97～106氨基酸區(qū)段。綜合CD2v蛋白的抗原決定簇位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲參數(shù)，確定CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)T淋巴細(xì)胞表位見(jiàn)表1。

輔助性T淋巴細(xì)胞(HTL)表位使用通用Th表位PADRE(AKFVAAWTLKAAA)，其可以和大多數(shù)的MHC-Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合，然后刺激CD4+的Th細(xì)胞活化,在一定程度上可以克制結(jié)合識(shí)別上的限制性，增強(qiáng)抗原表位的免疫原性，有利于更好地發(fā)揮表位作用[7]。

表1 CD2v蛋白的優(yōu)勢(shì)B、T淋巴細(xì)胞表位篩選Table 1 CD2v protein dominant B and T lymphocyte epitopes screening

2.9 多表位重組蛋白及其多表位疫苗的設(shè)計(jì)

2.9.1 多表位重組蛋白的設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)綜合對(duì)比多種預(yù)測(cè)結(jié)果之后，最終選取了優(yōu)勢(shì)抗原表位，如表1所示。將T淋巴細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞表位首尾相連，串聯(lián)成多肽表位，然后在兩端加上限制性酶切位點(diǎn)NdeI和Xhol I[18](圖5)。為了相關(guān)蛋白酶適當(dāng)?shù)那懈睿x擇了2個(gè)賴(lài)氨酸(KK)作為B、T淋巴細(xì)胞表位之間的間隔序列，既不構(gòu)成新的表位又能夠使各表位發(fā)揮獨(dú)立作用，而其余表位之間的Linker序列選擇GGGGS柔性間隔序列，既可使融合蛋白在體內(nèi)的作用時(shí)間延長(zhǎng)，又能避免新的結(jié)合表位的出現(xiàn)[11]。

圖5 CD2v多表位重組蛋白示意圖Fig.5 CD2v multiepitope recombinant protein diagram

表位氨基酸為：AKFVAAWTLKAAAGGGGSITNDNNDGGGGSCGKAGNFCECSNYSTSGGGGSITNNCSLTIGGGGSNWNNSNINNGGGGSNTISTSNETTLINCTKKTIFPHNDVFGGGGSHNDVFDTTYGGGGSYTNESILEY設(shè)計(jì)的亞單位疫苗必須是穩(wěn)定和有免疫原性并且無(wú)過(guò)敏性的[9]，所以利用ExPASy分析重組蛋白的理化性質(zhì)，該蛋白的分子量為13 152.93Da，理論等電點(diǎn)為4.78，含有9個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸，5個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸，不穩(wěn)定性系數(shù)為37.73，GRAVY值為-0.477， 為穩(wěn)定親水性蛋白。VaxiJenV預(yù)測(cè)免疫原性參數(shù)是0.661 5。過(guò)敏是由多種內(nèi)部或外部因素引起一系列復(fù)雜的反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥和其他癥狀[12]。利用AllerTopV預(yù)測(cè)致敏參數(shù)，其為非致敏原，最接近的蛋白是水稻的轉(zhuǎn)錄因子NFYB3(UniProt登錄號(hào):Q60EQ4)。

2.9.2 多表位疫苗的優(yōu)化 利用JCAT對(duì)重組蛋白進(jìn)行反向翻譯為核苷酸序列，并對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果為:GCTAAATTCGTTGCTGCTTGGACCCTGAAAGCTGCTGCTGGTGGTGGTGGTTCTATCACCAACGACAACAACGACGGTGGTGGTGGTTCTTGCGGTAAAGCTGGTAACTTCTGCGAATGCTCTAACTACTCTACCTCTGGTGGTGGTGGTTCTATCACCAACAACTGCTCTCTGACCATCGGTGGTGGTGGTTCTAACTGGAACAACTCTAACATCAACAACGGTGGTGGTGGTTCTAACACCATCTCTACCTCTAACGAAACCACCCTGATCAACTGCACCAAAAAAACCATCTTCCCGCACAACGACGTTTTCGGTGGTGGTGGTTCGCATAACGACGTCTTCGACACCACATACGGTGGTGGTGGTTCTTACACCAACGAATCTATCCTGGAATAC

2.9.3 多表位疫苗的構(gòu)建 將所設(shè)計(jì)的多表位疫苗的核苷酸序列直接與pET28a相應(yīng)NdeI和Xhol I酶切位點(diǎn)連接合成。

3 討論

ASFV近年來(lái)傳入我國(guó)，目前尚無(wú)疫苗可以用于臨床防治，對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此研發(fā)針對(duì)ASFV有效防控的疫苗刻不容緩。目前雖然針對(duì)ASFV的特異性抗原進(jìn)行了多種疫苗研究嘗試，但是許多嘗試都沒(méi)有經(jīng)過(guò)攻毒試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估[13]。而且目前有關(guān)ASFV的保護(hù)性抗原尚不完全清楚，雖然已有研究表明p30、p54、p72和CD2v等多個(gè)蛋白能夠產(chǎn)生一定量的中和抗體，但是都不能完全的中和ASFV的感染。多表位疫苗和傳統(tǒng)疫苗相比起來(lái)，能夠同時(shí)引起體液免疫和細(xì)胞免疫，可以更好的增強(qiáng)疫苗的免疫效力，更有效地發(fā)揮疫苗的保護(hù)作用[14]。全球的ASFV毒株可以被分為24個(gè)基因型，8個(gè)血清型，雖然目前從天然毒株中分離到了CD2v基因缺失株，但是目前在歐洲、亞洲、大洋洲流行的為強(qiáng)毒力的基因Ⅱ型毒株[13]。有研究表明，CD2v蛋白的免疫原性良好，既能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生ASFV特異性抗體又能刺激T細(xì)胞應(yīng)答[15]，探索CD2v蛋白的結(jié)構(gòu)以及在ASFV感染時(shí)的作用，成為研究熱點(diǎn)。生物信息學(xué)目前在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能方面的應(yīng)用比較多，可以準(zhǔn)確地分析蛋白的抗原表位，減少了工作量，提高了工作效率，在疫苗研發(fā)方面應(yīng)用非常廣泛[16]。

本試驗(yàn)應(yīng)用各類(lèi)生物信息學(xué)方法對(duì)Georgia 2007/1株CD2v蛋白的理化性質(zhì)、抗原特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并以此設(shè)計(jì)多表位疫苗。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白是跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，具有信號(hào)肽，并且有較長(zhǎng)的胞外區(qū)(1～206 aa)，為親水性蛋白，柔韌性較好，該蛋白有11個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，并且利用VaxiJenV預(yù)測(cè)，抗原指數(shù)為0.523 1，并綜合圖3的表面可及性分析說(shuō)明該蛋白有抗原性，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。另外進(jìn)一步對(duì)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，CD2v蛋白占總氨基酸的比重較多的是β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲能夠突出于蛋白的表面，且表面可及性較強(qiáng)，容易形成抗原表位[7]，CD2v蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲和β轉(zhuǎn)角占的比重較大，也說(shuō)明了CD2v蛋白容易形成抗原表位。以上說(shuō)明了CD2v蛋白具有潛在抗原表位，確實(shí)具有免疫原性，可以作為ASFV流行的基因Ⅱ型毒株以及其他含有CD2v蛋白的基因型毒株的疫苗研發(fā)的候選蛋白。綜合β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、親水性指數(shù)、表面可及性、抗原結(jié)構(gòu)域、柔韌性分析，同時(shí)使用ABCpred、NetMHCpan預(yù)測(cè)，得到優(yōu)勢(shì)B、T淋巴細(xì)胞表位，并且設(shè)計(jì)了多表位疫苗[11]。通過(guò)生物信息方法對(duì)所設(shè)計(jì)的多表位疫苗進(jìn)行評(píng)估，根據(jù)參數(shù)可知該疫苗穩(wěn)定，無(wú)過(guò)敏性，并且有免疫原性。

本試驗(yàn)在生物信息學(xué)層面對(duì)CD2v蛋白的結(jié)構(gòu)和抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并且根據(jù)B、T淋巴細(xì)胞的抗原表位設(shè)計(jì)了多表位疫苗，為CD2v蛋白的功能研究和ASFV的疫苗研發(fā)提供了一定的參考。