基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析心寶丸治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征的成分與機(jī)制

趙慧敏，邢方凱，楊昌林△

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九七零醫(yī)院高干一科，山東煙臺(tái) 264001；2.中國人民解放軍71217部隊(duì)，山東煙臺(tái) 266600)

病態(tài)竇房結(jié)綜合征(sick sinus syndrome，SSS)也稱為竇房結(jié)功能障礙(sinus node dysfunction，SND)，由竇房結(jié)節(jié)病變引起，表現(xiàn)為心臟起搏功能受損和沖動(dòng)傳遞異常的一系列癥狀，通常包括房性緩慢性心律失常、房性快速心律失常、快速型和慢性型心律失常并存的“快-慢綜合征”[1]。SSS所引起的心律失常可能會(huì)導(dǎo)致心肌和組織灌注不足，從而出現(xiàn)疲勞、頭暈、心悸和暈厥等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命。目前，針對(duì)存在明顯心動(dòng)過緩、竇性停搏的患者，治療方式以置入心臟起搏器為主，具有有創(chuàng)性、存在多種并發(fā)癥、治療和維護(hù)費(fèi)用高等不足[2]。心寶丸有溫補(bǔ)心腎、益氣助陽和活血通脈的功效，在治療各種心律失常，尤其是SSS等緩慢型心律失常中具有一定的療效；然而，目前對(duì)于心寶丸治療SSS的機(jī)制僅從中醫(yī)理論進(jìn)行解釋，其藥物有效成分及其與機(jī)體相互作用的關(guān)系尚缺乏認(rèn)知。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析是近年來被廣泛應(yīng)用的研究方法，可以通過結(jié)合中藥的成分化學(xué)，將藥理學(xué)信息與疾病相關(guān)基因聯(lián)系起來，通過全面分析藥物成分、生物學(xué)功能、基因和蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，嘗試闡釋中藥單藥或方劑的治療機(jī)制，為中醫(yī)藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。目前國內(nèi)外關(guān)于心寶丸的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析研究較少，現(xiàn)將心寶丸治療SSS的機(jī)制報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 主要成分的檢索、篩選和作用靶點(diǎn)的確定

通過TCMSP(https://tcmspw.com/)和中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/)，分別以洋金花、人參、肉桂、附子、鹿茸、冰片、人工麝香、三七、蟾酥為關(guān)鍵詞檢索各味中藥的化學(xué)成分。以口服利用度大于或等于30%且類藥性大于或等于10%作為篩選條件，對(duì)檢索到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選。使用TCMSP數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表文獻(xiàn)對(duì)篩選出的化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)進(jìn)行查詢，并將靶點(diǎn)與Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行匹配和規(guī)范。

1.2 SSS相關(guān)靶點(diǎn)的搜集、篩選和匹配

通過在Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)、Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)及DisGeNet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)中檢索sick sinus syndrome，將檢索獲得的重復(fù)內(nèi)容去除。將SSS相關(guān)靶點(diǎn)與心寶丸有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，繪制韋恩圖(Venn diagram)并提取心寶丸有效成分治療SSS的潛在靶點(diǎn)基因。

1.3 藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的繪制

使用Cytoscape(V3.7.2)軟件對(duì)搜索到的各味藥物及其有效成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，其中，以各味藥物及其有效成分和作用靶點(diǎn)作為節(jié)點(diǎn)，以三者間的相互關(guān)系作為連接線，構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值(degree)和中介核心性(betweenness centrality)，以度值和中介核心性評(píng)價(jià)不同節(jié)點(diǎn)的重要性(值越大代表在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越高)。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路和基因本體(GO)功能分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)和Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/)對(duì)潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路和基因本體功能的富集分析，使用R語言ggplot2包對(duì)其中P<0.05的信號(hào)通路和功能進(jìn)行圖形化顯示。其中，基因本體總共有三大類，分別是生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞定位(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)，各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能，所處的細(xì)胞環(huán)境，以及參與的生物學(xué)過程。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

使用Cytoscape插件BisoGenet(V3.0.0)構(gòu)建心寶丸有效成分治療SSS的潛在靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值和中介核心性，以度值和中介核心性的2倍中位數(shù)為截點(diǎn)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 心寶丸活性成分及其靶點(diǎn)

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫初步提取化學(xué)成分，其中，洋金花76種，人參190種，肉桂100種，附子65種，冰片31種，鹿茸37種，麝香11種，蟾酥3種，三七119種。經(jīng)過口服利用度和類藥性篩選后獲得的化學(xué)成分中洋金花12種，人參18種，肉桂5種，附子5種，冰片2種，鹿茸11種，麝香9種，蟾酥1種，三七8種。再將上述化學(xué)成分輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對(duì)應(yīng)的成分作用靶點(diǎn)，合并以后刪除重復(fù)值共得到有效成分作用靶點(diǎn)271個(gè)。心寶丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)重要性排前10的有效成分中，來源自人參的有5種(山柰酚、人參二醇、人參皂苷Rh2、人參炔C和β-谷甾醇)，三七2種(9,12-十八烷二烯酸甲酯和10,13-十九碳二烯酸)，洋金花2種(白曼陀羅素和東莨菪堿)，肉桂1種(檜烯)，見圖1。

2.2 心寶丸治療SSS的核心靶點(diǎn)及蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系

通過Drugbank和Uniprot 等數(shù)據(jù)庫檢索，共收集到1 165個(gè)SSS相關(guān)靶點(diǎn)。將心寶丸有效成分靶點(diǎn)和SSS相關(guān)基因進(jìn)行匹配后，得到31個(gè)心寶丸治療SSS的潛在靶點(diǎn)基因，見表1。

表1 心寶丸有效成分治療與SSS的潛在基因

續(xù)表1 心寶丸有效成分治療與SSS的潛在基因

2.3 心寶丸有效成分治療SSS核心靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路

KEGG富集分析顯示，在得到的131條信號(hào)通路中，包括PI3K-Akt、MAPK、cAMP、膽堿能突觸、AGE-RAGE、心肌細(xì)胞中的腎上腺素受體、腎素分泌、胰島素分泌、多巴胺能突觸和醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收等信號(hào)通路，見圖2。

圖2 心寶丸有效成分治療SSS核心靶點(diǎn)的KEGG分析氣泡圖

2.4 心寶丸有效成分治療SSS核心靶點(diǎn)的基因本體功能分析

基因本體功能富集分析顯示，在總共1 220項(xiàng)功能中，生物過程1 089項(xiàng)，主要涉及心臟過程、血液循環(huán)、NO相關(guān)反應(yīng)、體液調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、器官生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)和第二信使介導(dǎo)的信號(hào)等；分子功能74項(xiàng)，主要涉及G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、激酶活性、支架蛋白結(jié)合、電壓門控離子通道活性、激素結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、有機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和蛋白質(zhì)同源二聚活性等；細(xì)胞定位57項(xiàng)，主要涉及質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、突觸后膜、細(xì)胞間連接、細(xì)胞基部、細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)、線粒體外膜和分泌顆粒腔等，見圖3。

圖3 心寶丸有效成分治療SSS核心靶點(diǎn)的基因本體功能分析

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

使用Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫桨?0個(gè)節(jié)點(diǎn)的核心網(wǎng)絡(luò)，其中，SCN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因是核心靶點(diǎn)，見圖4。

圖4 心寶丸治療SSS靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

SSS所導(dǎo)致的大腦、心臟、腎臟和其他器官的血液供應(yīng)不足嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)其伴有的心臟猝死風(fēng)險(xiǎn)，明顯降低了SSS患者的預(yù)期壽命。盡管近年來我國以起搏器為代表的心臟植入性器械手術(shù)量明顯增加，但遠(yuǎn)不能滿足治療需求[3]，且治療費(fèi)用和治療不良反應(yīng)率較高，限制了起搏器在SSS治療中的應(yīng)用[4]。研究相關(guān)中藥治療SSS等疾病的機(jī)制，有助于在現(xiàn)有條件下提高SSS患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。

本研究通過在相關(guān)數(shù)據(jù)庫中分析心寶丸的有效化學(xué)成分，并對(duì)口服利用度和類藥性進(jìn)行篩選后獲得了心寶丸中9味中藥材的71種有效化學(xué)成分及271個(gè)有效成分作用靶點(diǎn)。在構(gòu)建和分析心寶丸藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)后，可見在重要性前10的有效成分中，人參有5種，三七3種，洋金花2種，肉桂1種，這提示人參、三七、洋金花和肉桂在心寶丸治療SSS中可能具有更加重要的作用。其中，白曼陀羅素除了具有抗癌作用外[5]，還被證實(shí)可以與腎上腺素能和多巴胺受體結(jié)合，并表現(xiàn)出較高的抗氧化、抗炎癥和抑制蛋白激酶活性的作用[6]；東莨膽堿為一種常見的顛茄類生物堿，具有抗膽堿能藥物活性，作為副交感神經(jīng)系統(tǒng)節(jié)后M受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，具有明顯的增快心率作用[7]；山柰酚為廣泛存在于茶、蔬菜和水果中的黃酮類化合物，對(duì)于包括血管內(nèi)皮炎癥在內(nèi)的急性和慢性炎性反應(yīng)具有顯著的抑制作用[8]；檜烯[9]、9,12-十八烷二烯酸甲酯[10]、10,13-十九碳二烯酸[11]被證實(shí)具有抗炎和抗氧化活性；人參皂苷Rh2[12]、β-谷甾醇[13]、人參二醇和人參炔C作為人參的重要有效成分，在抗氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)及治療缺血性心臟病、急慢性心力衰竭、心律失常等方面的作用均被大量研究所證實(shí)。

本研究共收集到SSS相關(guān)靶點(diǎn)1 165個(gè)，與心寶丸有效成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配后，得到31個(gè)心寶丸治療SSS的潛在靶點(diǎn)基因。使用潛在靶點(diǎn)基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯狙芯康玫搅艘許CN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn)的包含20個(gè)節(jié)點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。SCN5A基因編碼心臟鈉通道基因的α亞基，SCN5A核心啟動(dòng)子區(qū)域和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的變異可導(dǎo)致鈉通道功能異常，進(jìn)而影響快速鈉電流(Nav1.5電流)[14]；既往SCN10A編碼的Nav1.8電流曾被認(rèn)為僅存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，近年來的研究則顯示其與心臟發(fā)育異常和傳導(dǎo)阻滯等病理過程中存在一定的相關(guān)性，在長(zhǎng)QT綜合征、進(jìn)行性心臟傳導(dǎo)疾病和SSS的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[15]。EDN1基因則被認(rèn)為與竇房結(jié)非傳導(dǎo)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)相關(guān)通路在心血管疾病中有重要意義，被認(rèn)為與冠心病及原發(fā)性和繼發(fā)性竇房結(jié)功能障礙的發(fā)生有關(guān)[16]。胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGF)家族及其相關(guān)通路在心血管疾病中參與了多種調(diào)節(jié)途徑，IGF-2能夠維持新生血管生成、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[17]，并對(duì)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激及線粒體自噬發(fā)揮了促進(jìn)作用[18]。

對(duì)心寶丸治療SSS潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，可見PI3K-Akt、MAPK、cAMP、膽堿能突觸等可能為心寶丸調(diào)節(jié)SSS患者功能的信號(hào)通路；PI3K-Akt、MAPK、cAMP信號(hào)通路為第二信使介導(dǎo)的信號(hào)通路，這提示心寶丸可以通過調(diào)節(jié)SSS患者細(xì)胞內(nèi)第二信使來發(fā)揮作用[19]；膽堿能突觸相關(guān)通路在心臟功能調(diào)節(jié)中具有抑制心臟搏動(dòng)、降低血壓等作用，心寶丸可能通過抑制膽堿能突觸相關(guān)途徑進(jìn)而提高患者心率[20]。而GO分析顯示，心寶丸治療SSS的生物學(xué)過程集中在心臟過程、血液循環(huán)等生物過程，G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、激酶活性等分子功能，而功能定位涉及質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、突觸后膜、細(xì)胞間連接等。

綜上所述，白曼陀羅素、東莨菪堿、山柰酚和檜烯等是心寶丸治療SSS的潛在有效成分，心寶丸治療作用的核心靶點(diǎn)主要有SCN5A、EDN1、VEGFA、SCN10A、IGF2和VEGFB基因。但由于多種有效成分的相互作用及對(duì)竇房結(jié)功能調(diào)節(jié)等機(jī)制尚不明確，還有待進(jìn)一步研究分析心寶丸治療SSS的具體機(jī)制和途徑。