硅芯片納米微流體技術(shù)在無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測中的應(yīng)用研究*

周 俊，周 莉，馬 莉，郭曉輝

(廣東省深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科 518000)

自2011年以來，在臨床中已廣泛開展基于孕婦體內(nèi)循環(huán)中無細(xì)胞DNA的非侵入性產(chǎn)前檢查(noninvasive prenatal examination,NIPT)，但由于孕婦惡性腫瘤和胎兒胎盤鑲嵌癥等局限性，導(dǎo)致NIPT技術(shù)無法完全替代侵入性產(chǎn)前篩查。目前，SIMPSON[1]提出一種胎兒有核紅細(xì)胞(fetal nucleated red blood cells,fnRBC)在NIPT中應(yīng)用的方法，該方法不需要對胎兒進(jìn)行有創(chuàng)性取樣，并且fnRBC是有核細(xì)胞，可攜帶胎兒完整的遺傳信息，在NIPT的應(yīng)用中具有巨大潛力。但由于fnRBC在孕婦體內(nèi)數(shù)量極少，成功分離fnRBC存在較大的技術(shù)問題。迄今為止，已開發(fā)出多種技術(shù)，如熒光活化細(xì)胞分選、磁活化細(xì)胞分選、納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和離心等[2-6]技術(shù)方法用于fnRBC的富集，但都有一定的局限性。此外，也有研究表明胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblast,EVT)與母胎免疫和妊娠期母體常見并發(fā)癥的發(fā)生具有密切相關(guān)性[7]，EVT在產(chǎn)前基因檢測中具有重要參考價(jià)值。本研究設(shè)計(jì)開發(fā)一種新型的硅芯片納米微流體技術(shù)，在捕捉孕婦外周血fnRBC和EVT中具有一定優(yōu)勢，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2019年12月本院產(chǎn)科門診進(jìn)行產(chǎn)前篩查的孕婦為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)懷孕7周以上并在本院建冊產(chǎn)檢；(2)具有胎兒染色體異常危險(xiǎn)因素的孕婦(高齡、生育過染色體異常兒、超聲軟指標(biāo)2個(gè)以上異常等)；(3)存在可能胎盤源性疾病危險(xiǎn)因素的孕婦(妊娠高血壓疾病、妊娠期急性脂肪肝、胎兒宮內(nèi)生長受限、血清學(xué)篩查指標(biāo)異常等)；(4)知情同意自愿參與本研究，并簽署同意書后，留取孕婦外周血8 mL，預(yù)處理并離心，備用。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕婦患有腫瘤病史、輸血史；(2)有免疫治療史；(3)雙胎妊娠。本研究中所使用的產(chǎn)前檢測技術(shù)已獲得國家專利(專利號：ZL201920958825.2)，同時(shí)，本研究已獲得醫(yī)院科研倫理委員批準(zhǔn)，如實(shí)告知孕婦及其家屬并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1納米硅芯片(PicoBioChip)制作

半導(dǎo)體制作流程如下：首先將p型(100)硅芯片按照半導(dǎo)體標(biāo)準(zhǔn)清潔程序去除環(huán)境污染物，利用半導(dǎo)體微影蝕刻技術(shù)定義出納米陣列結(jié)構(gòu)，使用化學(xué)沉積法使抗原沉積在硅芯片上，接著將芯片放置在HF/H2O2蝕刻混合溶液中進(jìn)行蝕刻；當(dāng)去除抗原膜后，形成具有多孔納米結(jié)構(gòu)的硅芯片；最后在芯片表面涂布與生物素具有特異性結(jié)合作用的鏈霉親和素，增強(qiáng)目標(biāo)細(xì)胞捕捉效率。

1.2.2細(xì)胞影像辨識系統(tǒng)(CAT)

經(jīng)過第一階段細(xì)胞捉捕后，在納米硅芯片上會(huì)擷取到目標(biāo)細(xì)胞與殘存的非目標(biāo)細(xì)胞。這些非目標(biāo)細(xì)胞大多是白細(xì)胞，其中，嗜中性白細(xì)胞的抗原表現(xiàn)通常會(huì)與目標(biāo)細(xì)胞相似。因此，需要通過第二階段的影像辨識系統(tǒng)來排除嗜中性白細(xì)胞并辨識出目標(biāo)細(xì)胞。本研究自主研發(fā)的CAT能與全自動(dòng)檢測系統(tǒng)搭配，對芯片上捕捉到的細(xì)胞依據(jù)特征及形態(tài)進(jìn)行分類，目前已成功開發(fā)出細(xì)胞影像辨識軟件，可在10倍顯微鏡下針對疑似循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)或循環(huán)胎兒細(xì)胞(CFCs)進(jìn)行影像海選，并以自主開發(fā)的細(xì)胞型態(tài)算法(CPA)及機(jī)器學(xué)習(xí)機(jī)制，自動(dòng)識別出符合擷取條件的目標(biāo)細(xì)胞。依據(jù)條件參數(shù)的不同，CAT能識別出CTCs或CFCs。CAT可顯示每個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的詳細(xì)信息，如細(xì)胞大小、染色強(qiáng)度及細(xì)胞位置等，供專業(yè)人員進(jìn)一步判讀。其中，每個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的位置信息能提供后續(xù)的“細(xì)胞分選擷取儀”明確知道該細(xì)胞在芯片上的準(zhǔn)確位置。

1.2.3擷取目標(biāo)細(xì)胞的回收

CAT識別出CTCs或CFCs后，再輔以全自動(dòng)微組織細(xì)胞分選儀擷取技術(shù) (細(xì)胞分離)，將其擷取得到的CTCs或CFCs用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)生物標(biāo)記特性研究，或利用熒光原位雜合技術(shù)、微數(shù)組與次世代定序NGS進(jìn)行基因分析。

1.2.4母血中的胎兒細(xì)胞擷取

每次實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)使用4個(gè)納米硅芯片進(jìn)行母血中胎兒細(xì)胞的擷取，其中2個(gè)用于EVT的抓取，另外2個(gè)用于fnRBC的抓取，每個(gè)納米芯片使用外周血8 mL，胎兒細(xì)胞的初步抓取是利用專一性抗體辨認(rèn)胎兒細(xì)胞表面抗原的方式進(jìn)行，其中EpCAM+用以辨認(rèn)EVT，而CD71+辨認(rèn)fnRBC，然后用CK7和HLA-G染色，利用自行開發(fā)的熒光顯微鏡檢查配備內(nèi)置的自動(dòng)檢測和圖像分析系統(tǒng),稱為細(xì)胞分析工具(CytoAuroraCATTM)，可于顯微鏡下自動(dòng)辨識胎兒細(xì)胞與母體本身的白細(xì)胞，并利用CK7+(Cytokeratin-7)/HLA-G+/CD45-/DAPI+(針對EVT)與CD71+/GPA+(glycophorin-A)/CD45-/DAPI+(針對fnRBC)的抗體組合，進(jìn)一步利用熒光標(biāo)定并區(qū)分不同的胎兒細(xì)胞類型[8-9]。本研究擷取的目標(biāo)細(xì)胞為fnRBC和EVT。

1.2.5fnRBC和EVT純度鑒定

將擷取到的fnRBC和EVT置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，而后將DMEM細(xì)胞懸液移入fnRBC和EVT培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放置在37 ℃，含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行免疫黏附，2～3 h后將培養(yǎng)皿取出，上下緩慢搖晃，而后將未黏附的細(xì)胞懸液吸取后移入無菌離心管，吹打混勻，在室溫條件下800 r/min離心5 min，快速倒去上清液，加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，通過免疫熒光法鑒定fnRBC和EVT純度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 鑒別fnRBC、EVT和母血WBC

用TRITC(CD45)標(biāo)記的抗體識別fnRBC，用FITC(CD71)標(biāo)記的抗體識別EVT，用Cy5(GPA)標(biāo)記的抗體識別母體白細(xì)胞，在熒光顯微鏡下根據(jù)細(xì)胞大小和顯色不同區(qū)分fnRBC、EVT和母血白細(xì)胞。見圖1。

A～E:fnRBC;F～J:EVT。圖1 熒光顯微鏡下fnRBC和EVT與母血白細(xì)胞(WBC)的鑒別

2.2 fnRBC免疫熒光顯示

為最終用母體外周血標(biāo)本驗(yàn)證硅芯片納米微流體技術(shù)在捕捉分離fnRBCs的性能，本研究對5例不同年齡和不同孕周被診斷為珠蛋白生成障礙性貧血的孕婦的血液標(biāo)本進(jìn)行測試。孕婦平均年齡(36.9±2.8)歲，平均孕周(20.2±2.3)周，通過Cy5+(GPA)、TRITC+(CD45)，F(xiàn)ITC+(CD71)、DAPI+(Nucleus) 四色免疫熒光染色法進(jìn)一步驗(yàn)證fnRBC。在FISH顯微照片中能較清晰地發(fā)現(xiàn)fnRBC不同顏色的免疫熒光，見圖2。

紅色:Cy5+(GPA);橙色:TRITC+(CD45);綠色:FITC+(CD71);藍(lán)色:DAPI+(Nucleus)。圖2 5例珠蛋白生成障礙性貧血孕婦外周血中分離的fnRBCs的FISH顯微照片

2.3 通過掃描電子顯微鏡顯示fnRBC和EVT顯微照片

顯微照片顯示硅芯片表面形貌由具有相同尺寸和空間的圖案化納米結(jié)構(gòu)組成，可見突起處顯示為fnRBC和EVT在硅芯片表面被捕捉，見圖3。

A:俯視圖;B:側(cè)視圖；箭頭：fnRBC和EVT。圖3 掃描電子顯微鏡顯微照片

2.4 捕捉fnRBC、EVT和鑒定細(xì)胞純度

每次取8 mL母體血，通過硅芯片納米微流體技術(shù)，每例孕婦進(jìn)行兩次檢測，其中第1次捕捉fnRBC數(shù)量平均值為(20.6±6.1)個(gè)/mL，第2次為(20.4±5.8)個(gè)/mL，兩次捕捉數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.362,P>0.05)，免疫熒光鑒定fnRBC純度為(95±2)%；第1次捕捉EVT數(shù)量平均值為(67.6±7.9)個(gè)/mL，第2次為(67.2±8.2)個(gè)/mL，兩次比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.592,P>0.05)，免疫熒光鑒定EVT純度為(93±1)%。詳見表1、圖4、5。

表1 捕捉fnRBC和EVT數(shù)量

圖4 兩次檢測捕捉fnRBC數(shù)量

圖5 兩次檢測捕捉EVT數(shù)量

3 討 論

產(chǎn)前篩查對唐氏綜合征等出生缺陷的早期診斷和治療至關(guān)重要，目前，主要通過侵入性的方法進(jìn)行產(chǎn)前檢測，如羊膜穿刺術(shù)和絨毛取樣(CVS)，這些方法通常伴隨著高風(fēng)險(xiǎn)性，如羊水污染或羊水滲漏等[10-11]，因此，人們對產(chǎn)前篩查的安全性提出了更高的要求。近幾年，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者在非侵入性方式篩查胎兒遺傳性出生缺陷方面進(jìn)行了深入研究，并開發(fā)一種基于無細(xì)胞胎兒DNA(cffDNA)或fnRBC的檢測方法[12]，該方法不需要對未發(fā)育胎兒檢測材料進(jìn)行有創(chuàng)性取樣。cffDNA在母體血漿中含量豐富，易于收集[13-15]，唐氏綜合征等檢出率接近99%，假陽性率小于0.1%。目前，cffDNA在有些醫(yī)療機(jī)構(gòu)已被作為產(chǎn)前篩查的生物標(biāo)志物之一。然而，基于cffDNA的產(chǎn)前篩查具有一定的缺陷[16]：首先，cffDNA很容易受到母體DNA的污染，因此，依據(jù)cffDNA進(jìn)行產(chǎn)前無創(chuàng)檢測需要深度測序，增加了成本，同時(shí)降低了稀有基因突變檢測的靈敏度。其次，cffDNA通常表現(xiàn)出碎片化，很難收集到完整結(jié)構(gòu)，無法檢測到基因的反轉(zhuǎn)/融合，對于一些遺傳性疾病的檢測存在盲區(qū)，這些內(nèi)在不足阻礙了cffDNA在單基因缺陷、隱性遺傳病等出生缺陷產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用[17]。作為一種替代方法，fnRBC是有核細(xì)胞，攜帶胎兒完整的遺傳結(jié)構(gòu)，在NIPT的應(yīng)用中具有巨大潛力[18]。然而，由于孕婦體內(nèi)fnRBC數(shù)量極少，如何準(zhǔn)確地判斷、識別、捕捉和分離fnRBC一直是面臨的一項(xiàng)技術(shù)難題。

迄今為止，已開發(fā)出多種技術(shù)，如熒光活化細(xì)胞分選、磁活化細(xì)胞分選、微流控裝置、納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)和離心等，用于fnRBC的捕捉和富集[19-21]。在這些方法中，用fnRBC特異性抗體捕捉細(xì)胞的熒光活化細(xì)胞分選和磁活化細(xì)胞分選方法具有良好的特異性和高通量。然而，相關(guān)學(xué)者通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：熒光活化細(xì)胞分選存在有細(xì)胞回收率低的不足，磁活化細(xì)胞分選存在有細(xì)胞純度低的缺陷，并且這兩種方法都需要對細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行離心或細(xì)胞裂解等預(yù)先處理，存在有引起細(xì)胞丟失或者被破壞的風(fēng)險(xiǎn)[22]。AGHAZ等[23]研制了一種微流控器件，通過精確的流量控制和參數(shù)設(shè)置，實(shí)現(xiàn)了fnRBC純度和回收率的提高，該方法通過制作交叉流微濾器，利用模型混合物對fnRBC進(jìn)行分類，實(shí)現(xiàn)了胎兒細(xì)胞(74.0±6.3)%的回收，能從細(xì)胞混合物中去除(46.5±3.2)%的紅細(xì)胞。CROSNIER等[24]也根據(jù)紅細(xì)胞大小和變形特征，設(shè)計(jì)一種將fnRBC從臍血中分離出來的一微柱過濾器裝置，平均每毫升母血獲得1.2個(gè)細(xì)胞。但上述兩種方法都有一些缺點(diǎn)，如低流量、有限的靈敏度和容易堵塞等。而YANG等[25]利用無細(xì)胞DNA條形碼單分子檢測技術(shù)，結(jié)合特異性抗體修飾的納米結(jié)構(gòu)基質(zhì)，通過納米表面與抗原抗體反應(yīng)的協(xié)同作用，對胎兒細(xì)胞的捕捉效率有明顯提高，特異性抗CD147抗體生物改性羥基磷灰石/殼聚糖可成功地從母體血液循環(huán)中回收fnRBC，平均每毫升母體血液中可捕捉14個(gè)fnRBC，但由于正常血細(xì)胞的非特異性結(jié)合，這種靜態(tài)分離裝置往往導(dǎo)致細(xì)胞純度低[26-27]。HUANG等[28]使用了半乳糖特異性凝集素結(jié)合從母體血液中分離fnRBC，獲得了滿意的fnRBC回收率，然而該技術(shù)耗時(shí)，并且非特異性吸附會(huì)導(dǎo)致純度降低[29]。基于密度的離心方法通常依靠密度差分離fnRBC，這種方法簡單，但純度低，細(xì)胞丟失高達(dá)(40±10)%[30]。YOO等[31]使用雙密度梯度系統(tǒng)從母體血液標(biāo)本中回收fnRBC，平均每10毫升血液標(biāo)本獲得20.9個(gè)細(xì)胞。通過以上論述可見，目前關(guān)于母體外周血中fnRBC的識別、捕捉、收集和分離等多種技術(shù)方法均存在一定的弊端和不足，因此，需要一個(gè)穩(wěn)定、高效、高純度的fnRBC分離平臺(tái)。

本研究利用生物抗原抗體的生化特性辨認(rèn)，再經(jīng)由半導(dǎo)體芯片的納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)捕捉最大量FnRBC、EVT，可直接進(jìn)行胎兒染色體及基因芯片檢查，突破了目前NIPT胎兒游離DNA檢測只能檢測13、18及21三對染色體的限制，只需一次性抽取母體外周血就可以對胎兒23對染色體及常見基因拷貝數(shù)異常、單基因病進(jìn)行產(chǎn)前診斷，更突破了侵入性產(chǎn)前診斷才能直接取得胎兒細(xì)胞的限制及時(shí)間限制，最早能在早孕7周就可檢出細(xì)胞，亦遠(yuǎn)遠(yuǎn)超前了侵入性產(chǎn)前診斷孕周(孕12～13周)的限制。本研究孕婦平均孕周為(20.2±2.3)周，最早1例孕周為18+4周，兩次捕捉到fnRBC細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值分別為(20.6±6.1)、(20.4±5.8)個(gè)/mL，捕捉EVT細(xì)胞個(gè)數(shù)平均值分別為(67.6±7.9)、(67.2±8.2)個(gè)/mL均明顯高于前期相關(guān)學(xué)者采取其他方法所捕捉相關(guān)細(xì)胞的個(gè)數(shù)[32-34]，并且本研究對每份標(biāo)本進(jìn)行兩次檢測所捕捉的fnRBC和EVT細(xì)胞數(shù)量差異不明顯。表明硅芯片納米微流技術(shù)在捕捉高齡產(chǎn)婦早期外周血液中fnRBC和EVT細(xì)胞中性能較為穩(wěn)定，出現(xiàn)偏倚和誤差的概率較低。同時(shí)，通過免疫熒光法鑒定fnRBC純度為(95±2)%、EVT純度為(93±1)%，均明顯高于前期相關(guān)學(xué)者[35-37]通過其他技術(shù)所捕捉到母體fnRBC和EVT的純度，表明采用硅芯片納米微流體技術(shù)能捕捉到母體外周血中純度較高的fnRBC和EVT細(xì)胞。

本研究只是通過硅芯片納米微流技術(shù)對識別、捕捉和分離母體外周血中fnRBC和EVT細(xì)胞的數(shù)量能力以及技術(shù)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。實(shí)際分離出來的fnRBC和EVT細(xì)胞還是有限，并沒有達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，對孕周小于18周產(chǎn)婦外周血中fnRBC和EVT的捕捉效果還需要進(jìn)一步地分析。本研究合作小組已經(jīng)采用快速Q(mào)F-PCR或FISH技術(shù)對fnRBC進(jìn)行3對常見染色體(21,13,18號)及性染色體進(jìn)行檢測[26]，下一步將完善fnRBC和EVT細(xì)胞分離技術(shù)，利用二代測序技術(shù)、基因芯片對fnRBC進(jìn)行基因微缺失、微重復(fù)及相關(guān)單基因病檢測，甚至全外顯子或全醫(yī)學(xué)基因組檢測。同時(shí)，將利用擷取到的EVT，通過基因芯片對胎盤源性疾病(妊娠期高血壓疾病、胎兒宮內(nèi)生長受限、妊娠期急性脂肪肝等)進(jìn)行大樣本量篩查，確定目的基因。

綜上所述，可見硅芯片納米微流體技術(shù)能較準(zhǔn)確捕捉、識別和分離高齡產(chǎn)婦早期外周血樣本中fnRBC和EVT，為進(jìn)行全面胎兒染色體及基因芯片檢查提供條件。此外，EVT細(xì)胞亦可提供胎盤病變及胎盤基因?qū)W的研究依據(jù)，這將有利于提高產(chǎn)前篩查測序精準(zhǔn)度及特異度，同時(shí)也大大提高了檢測的深度和廣度，對出生缺陷及遺傳疾病的早期篩查和防控提供臨床診斷依據(jù)具有深遠(yuǎn)意義。