基于16S rRNA基因測序分析不同喂養方式對食物過敏嬰幼兒腸道微生態的影響*

王 晶,黃麗英,陸俊佳,余 夏

(廣西醫科大學第三附屬醫院/南寧市第二人民醫院，南寧 530031)

食物過敏(food allergy，FA)的發生率目前逐年上升，有資料顯示8%的兒童、近5%的成年人存在FA[1]。雖然部分嬰幼兒的FA可隨年齡增長而自愈，但MIYAJI等[2]認為嬰幼兒期FA可能會成為嚴重過敏性疾病的重要誘因或加重因素。同時嬰幼兒因FA所致的優質蛋白、微量元素等物質攝入不足繼發的健康問題也時有報道[3]。有學者發現腸道菌群結構、機體腸道黏膜免疫功能和過敏反應密切相關，認為腸道微生態是引起FA的主要原因[4]。本研究應用Illumina第2代高通量測序技術研究不同喂養方式的FA嬰幼兒腸道菌群的差異，分析不同喂養方式對嬰幼兒腸道微生態的影響，以期為嬰幼兒FA的預防及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2019年3-10月于南寧市第二人民醫院初診為FA的嬰幼兒(n=44)，根據喂養方式的不同分為3組，純母乳喂養組:出生6個月內除母乳外，不給予配方奶或其他食物(糖水、維生素和鈣除外)；人工喂養組:出生后完全配方奶喂養；混合喂養組：出生6個月內除母乳外，給予配方奶補充喂養。選取同期進行健康體檢的健康嬰幼兒12 名作為對照組，4組研究對象性別、年齡、胎齡、出生體重、生產方式等差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 研究對象基本情況

FA嬰幼兒納入標準：(1)臨床診斷為FA；(2)年齡0～24個月；(3)無糖尿病、肥胖及其他代謝疾病；(4)無感染性疾病；(5)征得患兒監護人同意，并簽署知情同意書。

所有研究對象均通過問診獲得胎次、產次、胎齡、家族性過敏史、遺傳性疾病史等基本信息，且在糞便采集前1個月未使用抗生素、益生菌、益生元等。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1標本采集

采集研究對象新鮮成形大便的中段大便10 g，放入無菌采集盒后，1 h內置于-80 ℃保存，用于后期腸道微生物總DNA提取。

1.2.2微生物總DNA的提取和檢測

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)提取研究對象糞便中微生物總DNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，并對DNA進行定量。

1.2.3微生物DNA文庫的構建

經過檢測的DNA被超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段，用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4 PNK將打斷形成的黏性末端修復成平末端，并在3′端加堿基“A”，使DNA片段能與3′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接后，以目的DNA為模板，在含有測序接頭的融合引物引導下，進行融合引物聚合酶鏈反應后，磁珠篩選純化目的擴增片段。最后，用合格的文庫進行集群制備和測序。

1.2.4測序

應用Illumina平臺(Miseq)進行測序。

1.3 數據分析

樣本經過測序可得到大量序列，應用 mothur 軟件進一步處理，將相似度大于或等于97%的序列聚類形成1個臨時操作單元(operational taxonomic unit，OTU )，得到多個OTU。OTU一方面可用于計算樣本的Alpha 多樣性(chao1值、ACE值、Shannon指數等)，并判斷樣本物種的多樣性。另一方面 OTU注釋可明確樣本的物種組成和分類分項，在最佳分類水平上分析各研究對象物種組成的相似性。同時對樣本做主成分分析(PCA)，找出對造成樣本間差異貢獻較大的物種。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 研究對象腸道微生態樣本物種豐度及Alpha 多樣性的比較

4組研究對象糞便中的物種豐度(OTU數量)和多樣性指數均以母乳喂養組最低，其次是對照組，最高的是人工喂養組。4組間OTU數量存在明顯差異(P<0.05)。組間進一步比較，母乳喂養組和對照組的平均OTU數量明顯少于混合喂養組和人工喂養組，差異有統計學意義(P<0.05)。但母乳喂養組較對照組、混合喂養組較人工喂養組的平均OTU數量雖略有差異，但差異無統計學意義(P>0.05)。4組間Alpha 多樣性指數略有差異，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 研究對象樣本的物種豐度及Alpha多樣性

2.2 4組研究對象的腸道菌群結構

2.2.1FA嬰幼兒和健康嬰幼兒在腸道菌群分級門(Phylum)水平的分布比較

對研究對象的糞便進行微生物16S rRNA基因V3區測序，共檢測到12個菌門，相對豐度較高者為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)等5個菌門。進一步物種差異分析，厚壁菌門在研究對象中均有較高的相對豐度，但與對照組比較，FA嬰幼兒的厚壁菌門相對豐度更高。 擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門在4組間呈現明顯差異，擬桿菌門、梭桿菌門在母乳喂養組(28.5%和7.9%)和對照組(44.7%和13.7%)的相對豐度較人工喂養組(7.5%和0.6%)和混合喂養組(14.1%和0.5%)顯著增加。而放線菌門在人工喂養組和混合喂養組(19.2%和23.4%)的相對豐度較母乳喂養組(3.1%)和對照組明顯增加(1.0%)。從門分類水平物種注釋圖中可看出樣本之間也有明顯的個體差異，擬桿菌門在混合喂養組中的豐度可從3.2%上升到 38.6%；而放線菌門在混合喂養組各樣本中的比例也是從1.2%上升到42.8%，見圖1。

H001、H002：母乳喂養組；H003、H004：對照組；P001、P002、P003：混合喂養組；P004、P005、P006、P007：人工喂養組。圖1 4組研究對象腸道微生物菌群門水平的組成

2.2.2FA嬰幼兒和健康嬰幼兒在腸道菌群分級科(Family)水平的分布比較

物種注釋顯示最佳的分類水平為科，每個樣本均有98%以上的序列在該水平上得到分類。在科水平上，筆者對各樣本中豐度≥0.5%的科進行了統計。研究對象糞便樣本中相對豐度較高的科共檢測到24個(圖2)。母乳喂養組和對照組以螺旋菌科(Lachnospiraceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)為優勢菌，而人工喂養組和混合喂養組主要以螺旋菌科、瘤胃菌科(Rumioncoccaceae)為優勢菌。4組物種構成呈現多樣化，但4組間物種多樣性并未顯著差異。對所有樣本進行聚類分析發現，人工喂養組、混合喂養組和母乳喂養組、對照組的相似度很低，表明4組樣本菌群差異較大。進一步兩兩分析顯示，母乳喂養組、對照組的相似度較高，而人工喂養組和混合喂養組的相似度亦較高。PCA分析發現造成4組之間差異貢獻最大的類群為瘤胃菌科、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)和擬桿菌科。瘤胃菌科在對照組(3.4%)中相對豐度明顯低于母乳喂養組(13.3%)、混合組喂養組(23.6%)和人工喂養組(28.8%)。而擬桿菌科在對照組中(31.1%)的相對豐度卻明顯高于母乳喂養組(23.16%)、混合喂養組(8.16%)和人工喂養組(4.48%)。另外PCA分析還發現與母乳喂養組相似度較高的混合喂養組樣本中擬桿菌科相對豐度較高，而與人工喂養組相似的樣本中瘤胃菌科含量較高，見圖2。

H001、H002：母乳喂養組；H003、H004：對照組；P001、P002、P003：混合喂養組；P004、P005、P006、P007：人工喂養組。圖2 4組研究對象腸道微生物菌群科水平的組成

3 討 論

腸道微生態是指寄生于腸道的微生物與宿主之間相互作用、相互影響的共生關系統一體。有學者認為腸道定植的大量微生物是人類基因組信息的重要補充，與人體健康密切相關[5]。國內外研究亦表明腸道微生物群落的紊亂，將影響機體的免疫、代謝、神經、內分泌等系統，是誘發自身免疫性疾病、糖尿病、自閉癥、抑郁癥和癌癥等多種疾病的重要因素之一[6-7]。嬰幼兒時期是宿主腸道菌群建立的關鍵時期，而喂養方式是影響嬰幼兒腸道微生態的重要因素，它通過影響嬰兒腸道菌群的定植，進而影響腸道微生態的穩定性[8]。國內研究亦表明喂養方式與嬰兒腹瀉、過敏性疾病等有關系[9]。因此研究不同喂養方式所引起食物過敏的作用機制具有非常重要的臨床意義。早期對腸道微生態的研究主要采用傳統培養技術，但該方法具有局限性，只能檢測培養型的微生物，而培養型的細菌在腸道菌群中僅為1%～10%，與機體相互作用的非培養型菌群嚴重漏檢[10]。隨著核酸測序技術的發展和測序成本的降低，通量高、測序快、準確度高的高通量測序技術被廣泛應用在微生物的研究中，腸道微生態的研究亦逐漸使用該技術[11]，它幾乎可以檢測出糞便中所有菌群，對腸道微生物的構成有更全面、更深入的認識，對腸道病理學的研究具有巨大的促進作用。

本研究的結果顯示所有糞便樣本OTU數量最多可達到423，最少為126。OTU的數量代表樣本物種的豐度，表明研究對象糞便樣本中的微生物豐度很高，但樣本之間微生物豐度差異較大，母乳喂養組的平均OTU數量最少，其次為對照組，人工組最高。母乳喂養組和對照組的平均OTU明顯低于人工喂養組和混合喂養組，這與李在玲等[12]的研究結論一致，而母乳喂養的FA嬰幼兒的腸道細菌豐度較對照組無明顯差異，這提示健康嬰幼兒和母乳喂養的FA嬰幼兒維持腸道正常功能、代謝及抵御病原菌方面的腸道細菌豐度要低于人工喂養和混合喂養的FA嬰幼兒，進一步說明FA的發生、發展不僅可能與腸道定植的細菌豐度有關，還與遺傳因素有關。有學者認為微生物的構成多樣性，對宿主的表型有著重要的影響[13]。但本研究中4組間腸道菌群的Alpha 多樣性指數差異無統計學意義，說明菌群的相對豐度在宿主的表型中起到更加重要的作用。

本研究發現厚壁菌門是所有研究對象糞便樣本中的優勢菌，與FU等[14]的研究結果一致,厚壁菌門在宿主腸道上皮細胞供能和發育起到重要作用，當厚壁菌門的豐度減少，將引起機體糖類代謝異常。4組間腸道菌群結構差異主要在于擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門。擬桿菌門和梭桿菌門在母乳喂養組和健康嬰幼兒中的相對豐度較人工喂養組和混合喂養組高。擬桿菌門主要定植在腸黏膜表面，能抵御腸侵入性病原菌的黏附，為有益菌群。而梭桿菌門的梭桿菌已被證實可以抑制調節T細胞的增生，從而抑制組織的炎癥反應[14]。而人工喂養組和混合喂養組的放線菌門較母乳喂養組和對照組明顯增加。有學者發現放線菌門通過微生物的磷酸轉移酶系統能影響機體糖、脂、蛋白質代謝相關[15]。這可能是FA嬰幼兒容易營養不良的主要原因。

進一步分析腸道菌群結構，發現螺旋菌科是研究對象中的優勢菌，但健康嬰幼兒的相對豐度明顯低于FA嬰幼兒，這可能是嬰幼兒發生FA的原因之一。對所有樣本進行聚類分析顯示人工喂養組、混合喂養組、母乳喂養組、對照組的相似度很低。進一步兩兩分析發現母乳喂養組與對照組、人工喂養組與混合喂養組的相似度較高，提示人工喂養和混合喂養的嬰幼兒發生FA的原因可能與腸道菌群結構有關，而母親喂養的嬰幼兒發生FA的原因更傾向于遺傳因素。PCA分析發現導致4組之間差異貢獻最大的菌群為瘤胃菌科、雙歧桿菌科和擬桿菌科。瘤胃菌科在對照組中相對豐度明顯低于FA嬰幼兒，而擬桿菌科在健康嬰幼兒中的相對豐度卻明顯高于FA嬰幼兒。而研究已發現擬桿菌主要定植在腸黏膜表面，拮抗侵入性病原菌的黏附腸上皮細胞，是有益菌群[15]。同時PCA分析發現混合喂養嬰幼兒間的菌群結構差異與喂養情況有關，與母乳喂養較高的混合喂養組樣本中擬桿菌科相對豐度較高，而配方奶喂養較高的樣本中瘤胃菌科含量較高。

綜上所述，母乳喂養的FA嬰幼兒與健康嬰幼兒腸道微生態相似，而人工喂養和混合喂養的FA嬰幼兒腸道菌群結構和豐度與健康嬰幼兒存在差異，提示FA的發生、發展可能跟喂養方式不同所致的腸道微生態的改變有關。