促紅細胞生成素對大鼠剖宮產后創面愈合的促進作用*

玄振華，王洪萍，朱 坤，賀麗霞，趙 芳△

(1.山東省濟南市第二婦幼保健院婦產科 271100；2.山東省濟南市人民醫院婦產科 271100；3.萊蕪職業技術學院康復教研室，濟南 271100)

剖宮產是目前全球最常見的腹部手術之一。在過去很長一段時間里，剖宮產率一直在上升[1]。然而，作為一種分娩替代方法，剖宮產是一種對產婦和新生兒健康都具有風險的侵入性醫療行為[2]。許多剖宮產婦女術后傷口出現并發癥，包括血腫、傷口感染、傷口分離和傷口裂開[3]。此外，剖宮產術后子宮切口的不完全愈合也可導致許多臨床并發癥，如子宮破裂、繼發妊娠、異位妊娠、異常子宮出血[4]。現在臨床已經有包括皮下引流術和子宮修補術等手段來改善剖宮產后傷口愈合[5]，然而效果并不理想。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種造血因子，主要參與紅細胞的增殖和分化，增加血液循環中紅細胞數量[6]。現有研究認為EPO可促進血管生成，有利于創面及術后傷口愈合[7]。本實驗主要研究了EPO對大鼠剖宮產后傷口愈合及組織形態變化的影響，檢測了EPO處理后傷口拉伸強度和子宮破裂壓力的變化，同時研究了傷口組織中羥脯氨酸及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、成纖維生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板-內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31)的表達水平，旨在探討EPO對大鼠剖宮產后創面愈合的促進作用，以期為臨床治療和用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

妊娠14 d成年雌性Sprague-Dawley大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。大鼠均飼養在無特定病原體(SPF)級動物房內，室溫(23±1)℃，晝夜循環12 h。

1.2 儀器與試劑

重組大鼠EPO購自美國R&D Systems公司(貨號1306-RE-010)；PrimeScriptTM反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司(貨號RR037A)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號C0105)；PAS染色試劑盒購自青島捷世康生物科技有限公司(貨號GMS80131.3);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京建成科技有限公司。壓力傳感器和放大記錄器購自美國WPI公司。

1.3 方法

1.3.1實驗動物分組與剖宮產手術

將實驗大鼠分為對照組(9只)、EPO 10 U/kg組(9只)、EPO 100 U/kg組(9只)，EPO 1 000 U/kg組(9只)。大鼠在飼養環境下適應5 d后進行相應實驗，所有實驗動物可自由進食、飲水。大鼠妊娠第19天通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。剖宮產手術流程如下[7]：在大鼠下腹部切開3.0 cm，在子宮角中部沿腸系膜邊界縱行切口2.0 cm。通過子宮切開術輕輕擠壓大鼠幼崽和胎盤并取出，隨后對子宮和皮膚切口進行縫合。術后每2 天腹腔注射相應濃度EPO處理1次，在第28天通過過量二氧化碳麻醉并斷頸處死大鼠。

1.3.2皮膚傷口拉伸強度和子宮破裂壓測定

傷口拉伸強度和子宮破裂壓通過壓力傳感器測量和放大記錄器記錄。5 mm2×10 mm2皮膚組織在傷口邊緣緩慢向反方向拉，破斷強度/橫截面積可得拉伸強度。將子宮角縫合至子宮瘢痕遠端1.0 cm處，以防止輸卵管灌注液漏出。將導管從距離瘢痕1 cm處插入子宮內，縫線固定。導管的近端連接一個5 mL注射器，并通過三通閥連接壓力傳感器，壓力傳感器與放大記錄器相連。隨后向子宮內緩慢注入生理鹽水直至子宮破裂或滲漏，所獲得的最高壓力為子宮破裂壓。

1.3.3羥脯氨酸檢測

根據ELISA試劑盒說明書，對4組大鼠傷口組織上清液進行羥脯氨酸測定，試驗重復3次。

1.3.4組織學分析

將大鼠用過量乙醚麻醉后取傷口組織和子宮組織(右子宮角)。子宮組織快速固定于4%多聚甲醛緩沖液中，24 h后進行石蠟包埋處理。用切片機制作4 μm厚度組織切片，HE或PAS染色觀察子宮組織形態學變化。

1.3.5實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

通過TRIzol試劑盒從傷口組織中提取總RNA。RNA通過PrimeScriptTM反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，隨后將cDNA作為RT-qPCR的模板，在iQTMSYBRE Green Supermix(Bio-Rad)體系中進行實時PCR。引物序列設計如下，TGF-β1：上游引物5′-CCA AGC TTA TGC CGC CCT CCG GGC-3′；下游引物5′-GCG TCG ACC AGC TGC ACT TGC AGG AG-3′;bFGF：上游引物 5′-TGC CAG TGG TTA CGA TT-3′;下游引物5′-TAG GAA TAC TGC CAT CAC-3′；CD31：上游引物5′-CCG CTC GTG AAA TGT TTA GG-3′；下游引物5′-CAG AGC AGG GTC CGA GGT A-3′；β-actin：上游引物5′- GGA AAT CGT GCG TGA CAT TA-3′；下游引物 5′- GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3′。PCR條件：94 ℃ 10 min預變性；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 34 s延伸，共40次循環。采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達水平。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 EPO對大鼠皮膚傷口拉伸強度和子宮破裂壓的影響

術后第28天，EPO 100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組較對照組皮膚傷口拉伸強度、子宮破裂壓顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

A：傷口拉伸強度；B：子宮破裂壓；a：P<0.01，與對照組比較。圖1 EPO對大鼠皮膚傷口拉伸強度和子宮破裂壓的影響

2.2 EPO對剖宮產后大鼠傷口組織中羥脯氨酸水平的影響

術后第28天，EPO 100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組大鼠傷口組織中羥脯氨酸水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

a：P<0.01，與對照組比較。圖2 EPO對剖宮產后大鼠傷口組織中羥脯氨酸水平的影響

2.3 EPO對大鼠剖宮產后子宮組織形態的影響

HE染色結果顯示，與對照組大鼠子宮內膜組織比較，EPO 100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組大鼠子宮內膜上皮高度、子宮內膜腺體數量及活性(箭頭所示)、子宮血管密度顯著增加。PAS染色結果顯示，EPO 100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組大鼠子宮內膜腺體活性(箭頭所示)及子宮血管密度增加，見圖3。

S:子宮內膜上皮高度;G:子宮內膜腺體數量；Bv:子宮血管密度。圖3 EPO對大鼠剖宮產后子宮組織形態的影響(200×)

2.4 EPO對大鼠剖宮產后傷口組織中TGF-β1、bFGF、CD31表達的影響

與對照組比較，10 U/kg組、100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組大鼠傷口組織中TGF-β1 mRNA相對表達水平顯著增加(P<0.01，P<0.001)，而EPO 100 U/kg組、EPO 1 000 U/kg組傷口組織中bFGF、CD31 mRNA的相對表達水平也顯著增加(P<0.01)，差異均有統計學意義，見圖4。

A：TGF-β1;B:bFGF;C:CD31；a：P<0.01，與對照組比較。圖4 PCR檢測EPO對大鼠剖宮產后傷口組織中TGF-β1、bFGF、CD31表達的影響

3 討 論

研究[8]表明，通過剖宮產手術分娩的女性再次受孕期間子宮破裂風險將會上升。雖然剖宮產后子宮瘢痕破裂的風險相對較低，但皮膚傷口并發癥及子宮切口不完全愈合并發癥仍然影響孕婦和嬰兒的健康[9]。本實驗通過檢測EPO處理后剖宮產大鼠皮膚傷口拉伸強度和子宮破裂壓，發現EPO可顯著增加大鼠剖宮產后皮膚傷口拉伸強度和子宮破裂壓。為了查明EPO促進愈合的機制，本研究檢測了EPO對剖宮后大鼠傷口組織中羥脯氨酸水平的影響，結果發現，100 U/kg和1 000 U/kg的EPO可顯著升高子宮內膜腺體數量和子宮血管密度，顯著增加傷口組織中羥脯氨酸的水平；同時，傷口愈合過程需要新的膠原蛋白合成，體內大約99.8%的羥脯氨酸儲存在膠原中，因此羥脯氨酸的測定可以作為膠原總量的標志物[10]。以上證據證明了EPO對剖宮產術后傷口愈合具有促進作用。

EPO是促進哺乳動物紅細胞增殖和分化的主要細胞因子，現有研究表明，EPO可促進創傷愈合并減少炎性反應，保護組織，促進血管再生及傷口的重構[11-12]。呂大倫等[13]研究發現，EPO治療14 d后，大鼠急性創面可全部愈合，而EPO在剖宮產后的傷口愈合中的研究卻未見報道。在皮膚和子宮組織中，拉伸強度是評價傷口愈合最常用的參數。較高的拉伸強度反映了較快的愈合過程，而瘢痕組織的拉伸強度明顯弱于正常組織。子宮創傷的愈合不良可以增加子宮破裂的風險，而愈合良好的子宮可以降低破裂的風險。血管生成是傷口愈合過程中必不可少的環節，現有研究也顯示EPO具有促進血管生成的作用[14]。本研究HE和PAS染色結果顯示，EPO可顯著增加子宮內膜腺體數量和子宮血管密度。

傷口愈合是一個復雜的信號傳導過程，曾娟妮等[15]研究報道TGF-β1/Smad3信號轉導通路參與皮膚創面愈合過程，抑制該通路可促使創面愈合速度加快。血小板和白細胞釋放的 TGF-β1是一種多功能細胞因子，在細胞遷移、增殖、分化、凋亡和細胞外基質中起著重要作用[16]。而本研究發現傷口組織中TGF-β1 mRNA相對表達水平升高。TGF-β1在EPO促進傷口愈合中的作用還需要進一步研究。bFGF是成纖維細胞和血管內皮細胞的調節因子，在組織再生和修復中發揮重要作用[17]。本研究結果顯示EPO可顯著升高傷口組織中bFGF mRNA相對表達水平。CD31是細胞黏附分子Ig超家族成員，可在血管和造血細胞中表達，CD31在炎癥中起著至關重要的作用，現有研究認為CD31是慢性炎性反應的負調節因子[18-20]。本研究結果顯示EPO可能通過上調CD31的表達來減輕炎性反應。本研究仍有諸多不足之處，對于子宮內膜厚度和子宮內膜腺體數量的測算基于HE染色觀察，精密的計算仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示EPO可通過增加TGF-β1和bFGF表達，減輕炎性反應，促進剖宮產后傷口愈合，為臨床剖宮產術后并發癥提供了新的治療途徑。