miR-375在骨關節炎軟骨中的表達及對軟骨細胞增殖和凋亡的影響

劉 旭，陳洪濤，那次克道爾吉，何 云，曹 力

骨關節炎是一種中老年人群中常見的慢性退行性關節疾病，以關節軟骨的退變為主要病理改變。軟骨退變早期尚在可逆期，后期逐漸出現軟骨缺損，進而發展成不可逆損傷，晚期患者主要以手術治療為主[1-2]。Pagenstert et al(2009年)發現，養分供應缺失、異常機械負荷、創傷、遺傳傾向等多項因素均可導致骨關節炎的發生。然而，目前臨床用于治療骨關節炎的藥物大多只能起到緩解關節疼痛的作用，患者的關節損傷無法得到根本改善[3]，嚴重影響身體健康和生活質量[4]。因此，發現骨關節炎的發病機制，并在此基礎上開展新的治療措施對治療骨關節炎意義重大。miR-375是一類內源性、非編碼的小分子RNA，可調節靶基因的表達，參與細胞發育、增殖、分化、凋亡等多種生理過程，在治療類風濕關節炎、過敏性鼻炎、支氣管炎癥等疾病中發揮作用[5-7]，但其對骨關節炎的作用尚未得知。2017年1月～2020年1月，我們收集60例行膝關節置換術患者的骨關節炎軟骨組織，并選擇20例正常軟骨組織作為對照進行研究，旨在探討miR-375在骨關節炎軟骨中的表達及對骨關節軟骨細胞增殖和凋亡的影響，以期為臨床治療骨關節炎提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1標本來源 納入標準：患者均符合《骨關節炎診療指南》[8]中有關膝骨關節炎診斷標準。排除標準：合并風濕或類風濕關節炎、化膿性關節炎等疾病。本研究納入60例，男31例，女29例，年齡48～70(64.55±6.34)歲。另選擇20例同期無骨關節炎病史者死后捐贈的正常軟骨組織標本(捐贈者死后2 h內取出股骨內、外髁負重過渡區的軟骨組織，取出后立即置于-80 ℃的液氮中保存)，男9例，女11例，年齡50～75(66.90±9.03)歲。兩組性別比、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意。

1.1.2主要試劑 DMEM培養基，甲苯胺藍染色液(上海索萊寶生物科技有限公司)，胎牛血清，青-鏈霉素混合液，0.25%的胰酶消化液，二甲基亞砜(DMSO,Gibco公司)，DEPC水(Sigma公司)，異丙醇，無水乙醇(上海振興化工一廠)，qRT-PCR試劑(DBI公司)，MTT(上海東仁化學科技有限公司)，Annexin V/PI染液(BD公司)，RIPA裂解液(上海申能博彩生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(Thermo公司)，SDS-PAGE凝膠，電泳液，轉膜液，TBST(上海鈺森生物技術有限公司)，脫脂奶粉(上海國藥集團)，ECL化學發光試劑盒(Millipore公司)，Bcl-2兔抗人單抗，Cleaved Caspase-3兔抗人單抗(Abcam公司)，HRP標記山羊抗兔IgG、兔抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體及免疫熒光試劑盒(Santa Cruze公司)。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(Esco公司)，CO2培養箱(Thermo electron corporation公司)，SpectraMax M5酶標儀(Molecular device公司)，高速低溫離心機(Eppendorf公司)，PCR擴增儀(Life technologies公司)，流式細胞儀(BD公司)，化學發光成像系統(GE公司)，搖床(TS-8，上海精密儀器制造公司)，電泳儀，轉膜儀(BIO-RAD公司)，TC處理細胞爬片24孔板、6孔板(上海索萊寶生物科技有限公司)。

1.2 骨關節軟骨細胞的分離、培養及鑒定

1.2.1骨關節軟骨細胞的分離、培養 采用酶兩步法獲取骨關節軟骨細胞，具體操作如下：將關節炎軟骨組織用磷酸鹽緩沖液清洗3次，仔細剔除附著滑膜、松質骨等多余組織。隨后將其置于培養皿中并加入足量的DMEM培養基，迅速地切成約1 mm3大小的顆粒，加入胰蛋白酶，在37 ℃的搖床中消化30 min。待軟骨組織基本溶解，收集細胞懸液，以1 000 r/min離心8 min，小心棄去上清液，磷酸鹽緩沖液沖洗3次。后加入含10 %胎牛血清的DMEM培養基中，制成關節炎軟骨單細胞懸液。

1.2.2骨關節軟骨細胞鑒定 ① 甲苯胺藍染色：將關節炎軟骨單細胞懸液用 4%甲醛固定，以甲苯胺藍染液進行染色5 min，光學顯微鏡下進行觀察并獲得圖像。② Ⅱ型膠原纖維染色：將關節炎軟骨單細胞懸液滴至爬片上，培養過夜后，使用交聯劑(如多聚甲醛)固定細胞進行通透封閉，加入兔抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體于4 ℃孵育過夜。次日加入二抗后室溫避光孵育1 h，滴加封片劑1滴后封片，熒光顯微鏡檢查。

1.3 實驗分組將關節炎軟骨單細胞懸液(2×105個)接種至6孔板，置于37 ℃恒溫，5% CO2培養箱內培養。待軟骨細胞生長至融合度80%時，采用Lipofectamine 2000分別將miR-375 inhibitor和miR-375 NC轉染至軟骨細胞，并分為miR-375 inhibitor組(轉染miR-375 inhibitor)、陰性對照組(轉染miR-375 NC)和空白對照組(不做任何處理)。

1.4 qRT-PCR方法檢測miR-375、Bcl-2和CleavedCaspase-3 mRNA的表達水平取0.5 cm×1.0 cm大小的骨關節炎軟骨組織和正常骨關節軟骨組織樣本，于液氮中充分研磨，分別加入1 ml Trizol提取組織及細胞總RNA，室溫下放置5 min，反轉錄獲得cDNA，miR-375以U6作為內參，Bcl-2及Cleaved Caspase-3以β-actin為內參。采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法檢測miR-375的表達水平及各組細胞中Bcl-2和Cleaved Caspase-3 mRNA的表達水平。引物序列見表1，每個樣品取10 μg cDNA，加入SYBR Green熒光染料。反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。擴增完畢后進行熔解曲線分析，根據內參，按公式(2-ΔΔCt法)計算miR-375、Bcl-2和Cleaved Caspase-3 mRNA的表達水平。

圖1 骨關節軟骨細胞的鑒定 A.骨關節軟骨細胞形態(×200)；B.骨關節軟骨細胞甲苯胺藍染色(×200)；C.骨關節軟骨Ⅱ型膠原纖維染色(×200)

表1 引物序列表

1.5 MTT法檢測各組細胞的增殖轉染48 h后，收集各組骨關節軟骨細胞，將0.5 g/L的MTT加入DMEM培養基，置于37 ℃恒溫，5% CO2培養箱中孵育4 h，然后去掉上清液，每孔加入100 μl的DMSO并輕震10 min，待其完全溶解后取出，使用酶標儀于避光下570 nm處檢測吸光度，檢測3次，取平均值，判斷24、48、72、96 h時細胞的增殖能力。

1.6 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡轉染48 h后，收集各組骨關節軟骨細胞(每樣本細胞數為2×107)，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的操作步驟進行細胞凋亡檢測。將不含EDTA的0.25%胰酶加入培養皿中進行細胞消化，以500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。用孵育緩沖液洗滌1次，再以500～1 000 r/min離心5 min。用100 μl的標記溶液重懸細胞。然后加入Annexin V和PI，室溫下避光孵育15 min，將處理好的細胞用流式細胞儀檢測凋亡水平。

1.7 Western blot檢測各組細胞中Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達轉染48 h后，收集各組骨關節軟骨細胞，加入裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測濃度，同樣品處理液混合后煮沸10 min，以每孔30 μg加樣，進行凝膠電泳(12% SDS-PAGE)，設置電壓為80～120 V，2 h。后于4 ℃、2 mA/cm2穩流轉膜(PVDF膜)2 h；5%脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃ 下與Bcl-2、Cleaved Caspase-3稀釋的一抗(1 ∶2 000)中孵育過夜，洗掉一抗，隨后加入HRP標記山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)，孵育2 h。TBST膜清洗3次；ECL發光法顯影，X線片上獲得黑色條帶，應用Quantity One 4.6.2檢測灰度值，計算Bcl-2、Cleaved Caspase-3條帶與β-actin條帶灰度值的比值。

2 結果

2.1 miR-375在骨關節炎軟骨組織和正常骨關節軟骨組織中的表達miR-375的表達水平在正常軟骨組織中為0.54～0.80(0.65±0.07)，在骨關節炎軟骨組織中為2.32～2.90(2.67±0.12)，差異有統計學意義(t=71.85，P<0.05)。

2.2 骨關節軟骨細胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察骨關節軟骨細胞形態呈三角或多角等不規則形狀，向四周爬行生長類似于成纖維細胞，見圖1A；甲苯胺藍染色顯示骨關節軟骨細胞及細胞外基質異染呈淺藍色或紫紅色，見圖1B；Ⅱ型膠原纖維染色后，軟骨細胞及胞外基質顯示為熒光，見圖1C。提示所提取培養的細胞為骨關節軟骨細胞。

2.3 miR-375在各組骨關節軟骨細胞中的表達見圖2。與空白對照組和陰性對照組比較，miR-375 inhibitor組miR-375相對表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組各時段比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 miR-375在各組骨關節軟骨細胞中的相對表達 與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

2.4 MTT法檢測各組骨關節軟骨細胞的增殖能力見表2。與空白對照組和陰性對照組比較，miR-375 inhibitor組細胞在各時段的增殖能力均減弱，差異均有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組各時段比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.5 流式細胞儀檢測各組骨關節軟骨細胞的凋亡情況見圖3。細胞凋亡結果顯示，與空白對照組和陰性對照組比較，miR-375 inhibitor組細胞的凋亡率顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 qRT-PCR法和Western blot法檢測各組骨關節軟骨細胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達見圖4、5。與空白對照組和陰性對照組比較，miR-375 inhibitor組Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，而Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平均明顯增高(P<0.05)。空白對照組與陰性對照組Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

正常生理狀態下，人體關節軟骨的合成和分解代謝保持著動態平衡，軟骨以及軟骨下骨持續處于該種動態改建過程中，從而維持人體關節的生理功能穩定。然而，在骨關節炎患者中軟骨內這一平衡被打破，進而引起臨床的相應癥狀[9]。隨著我國社會人口老齡化進程的加劇，骨關節炎已成為老年人致畸致殘的重要因素。然而，目前對于骨關節炎的發病機制仍不十分清楚，不能較完整地闡明其本質。故研究骨關節炎的發病機制及軟骨細胞增殖和凋亡的調控機制對預防、減緩及治療骨關節炎具有積極的意義。

miRNA 即微小RNA，是長度17～25個核苷酸序列的單鏈RNA分子，其不參加轉錄和翻譯過程，在真核細胞中廣泛表達。研究[10]證實，miRNA對許多生命活動起到了非常重要的調控作用，例如細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡和器官發育。miR-375定位于人2q35號染色體上，在進化上高度保守。文獻[11-13]報道miR-375在結直腸癌、口腔鱗癌、膠質瘤等疾病中皆有異常表達，但在關節炎發病機制中的作用尚不明確。本研究通過培養骨關節軟骨細胞后發現，骨關節炎軟骨組織中miR-375的表達水平要明顯高于正常軟骨組織(P<0.05)，提示miR-375在骨關節炎中高表達。采用Lipofectamine 2000分別將miR-375 inhibitor和miR-375 NC轉染至軟骨細胞并分組，發現miR-375 inhibitor組miR-375表達水平較其他兩組明顯降低，提示轉染成功。MTT結果顯示miR-375 inhibitor組較其他兩組來說，其各時段增殖能力被抑制，提示降低miR-375的表達能抑制骨關節軟骨細胞的增殖能力。值得注意的是，在骨關節炎進展過程中，軟骨細胞的過度凋亡對軟骨的破壞起到支配作用，并參與骨關節炎疾病的進程。而Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表達水平與細胞凋亡的調控密切相關。相關研究[14]表明，缺氧條件下促進人骨肉瘤細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達，同時抑制促凋亡蛋白Bax表達，誘導骨肉瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，miR-375 inhibitor組Bcl-2 mRNA和蛋白表達水平較其他兩組明顯降低，細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3 mRNA和蛋白表達水平較其他兩組顯著增高，提示降低miR-375能促進骨關節軟骨細胞凋亡，其作用機制可能與影響Bcl-2及Cleaved Caspase-3表達水平有關。

表2 各組骨關節軟骨細胞增殖能力的變化

圖3 各組骨關節軟骨細胞的凋亡情況 A.流式細胞儀檢測圖；B.定量圖，與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

圖4 各組骨關節軟骨細胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3 mRNA表達水平 與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

圖5 各組骨關節軟骨細胞Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平 A.蛋白印跡圖；B.定量圖，與miR-375 inhibitor組比較：*P<0.05

綜上所述，miR-375在人骨關節炎軟骨組織中過表達，降低miR-375的表達可能通過影響Bcl-2、Cleaved Caspase-3表達來抑制骨關節軟骨細胞的增殖能力，促進其凋亡。