linc00346調控膀胱癌細胞增殖的分子機制

葉挺宇，黃航，潘悅，蔡冰

溫州醫科大學附屬第一醫院 泌尿外科，浙江 溫州 325015

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，具有多中心性、易復發性、惡性程度高的特點，明確膀胱癌的發生機制對于膀胱癌診療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一類核苷酸長度超過200 nt，但不參與編碼蛋白的RNA。近年研究顯示，LncRNA的異常表達在多種腫瘤的進程中發揮著關鍵作用[1]。本課題組前期研究發現，linc00346與膀胱癌的發生發展密切相關[2]，但其具體分子機制尚不明確。PTEN是一種腫瘤抑制基因，定位于染色體10q23.3，具有雙重特異性磷酸酶活性，在對PI3K/Akt信號通路的調控中發揮著關鍵作用，能夠影響細胞的遷移、增殖及凋亡等重要過程[3]。本研究探討linc00346通過靶向PTEN調控PI3K/Akt通路對膀胱癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本：膀胱癌組織標本來源于溫州醫科大學附屬第一醫院泌尿外科根治性膀胱全切術后經病理確診為膀胱尿路上皮癌的手術存檔標本，共30例。配對的癌旁正常組織來源于同一患者的手術標本，距離膀胱癌瘤體3 cm以上，并經病理確診為正常組織。本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審批同意。

1.1.2 膀胱癌細胞系：人膀胱癌細胞系T24購自美國ATCC細胞庫（北京中原公司代理）。

1.1.3 主要試劑：RPMI-1640培養、胎牛血清（美國Gibco公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），GV248慢病毒載體系統（上海吉凱基因公司），SF1670（美國InvivoChem），Prime ScriptTMRT Master Mix（日本Takara公司），兔抗PTEN、p-Akt、Akt單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）試劑盒（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將T24細胞株置于含10% FBS的RPMI-1640培養液中，于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，每2～3 d更換1次新鮮培養基。待細胞生長至80%～90%融合時，進行細胞傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染：沉默linc00346表達的慢病毒載體GV248-linc00346-shRNA的構建由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司完成。調整細胞密度，以5×104細胞/孔接種于6孔板，按LipofectamineTM2000說明書進行操作，轉染慢病毒載體至T24細胞。轉染后實驗細胞分組情況：①空白對照組（Control）：未轉染慢病毒；②陰性對照組（Scramble）：轉染無關序列shRNA；③shRNA組：轉染干擾linc00346-shRNA?？瞻讓φ战M中加入PTEN特異性抑制劑SF1670（PTEN inhibitor組），以供后續實驗使用。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測目的基因表達量：取組織標本或對數生長期的各組T24細胞，按TRIzol試劑盒說明書操作，提取總RNA，紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度。按照Prime ScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒說明書進行操作，反轉錄合成cDNA，以β-actin作為內參，進行RT-PCR擴增。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共反應40個循環。β-actin引物序列為F：5’-GAAATCG TGCGTGACATTAA-3’，R：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；linc00346引物序列為F：5’-AGCTTGAATGGCGTTGGAAC CTATAG-3’，R：5’-ATAGTCCCTTCCTCGAATCCTAGT-3’；PTEN引物序列為F：5’-GGGACGAACTGGTGTAATGA-3’，R：5’-CGCCTCTGACTGGGAATAG-3’。目的基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4 蛋白質印跡（Western blot）法檢測PTEN和PI3K/Akt通路相關蛋白表達水平：取對數生長期的各組T24細胞，采用BCA法測定各組及標準品的蛋白濃度。加樣（50 μg/孔），制備SDS-PAGE膠，電泳分離，轉至PVDF膜上。于室溫下封閉2 h，加一抗（1:1 000），于4 ℃下孵育過夜。次日以TBST液洗膜3次，加二抗（1:4 000），室溫下孵育2 h，洗滌，ECL顯影。于Oddessy成像系統中掃膜，檢測條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算蛋白的相對表達量。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力：將各組T24細胞以1×103/孔的濃度接種于96孔培養板，分別在細胞培養至1～7 d時，加入CCK-8試劑10 μL，繼續孵育3 h。置入全自動酶標儀中，測定450 nm波長處各孔吸光度值（OD值），并以時間為橫軸、OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.3 統計學處理方法 運用SPSS17.0軟件進行分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 linc00346 mRNA、PTEN mRNA在膀胱尿路上皮癌組織中的差異表達 癌組織中linc00346 mRNA的相對表達量為1.985±0.169，癌旁正常組織中的相對表達量為0.915±0.067，膀胱癌組織中linc00346 mRNA呈現高表達（P＜0.05），見圖1A。癌組織中PTEN mRNA的相對表達量為0.535±0.054，癌旁正常組織中的相對表達量為1.113±0.069，膀胱癌組織中PTEN mRNA的表達水平明顯較低（P＜0.05），見圖1B。

圖1 膀胱癌及膀胱組織中linc00346和PTEN的差異表達

2.2 抑制linc00346對PTEN表達和PI3K/Akt通路的影響 RT-PCR檢測結果顯示，shRNA組linc00346 mRNA的表達水平（0.397±0.023）與Control組（1.243±0.041）及Scramble組（1.237±0.021）比較顯著降低（均P＜0.05），Control組與Scramble組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2A，說明沉默linc00346成功。與Control組（1.112±0.044）及Scramble組（1.131±0.026）比較，shRNA組（1.963±0.067）PTEN mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.05），見圖2B。

圖2 抑制linc00346對PTEN表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與Control組及Scramble組比較，shRNA組的PTEN蛋白水平升高，p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），而總Akt蛋白水平變化不明顯（見圖3）。Control組與Scramble組間上述蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖3 沉默linc00346對PI3K/Akt信號通路的影響

2.3 PTEN抑制劑對PI3K/Akt通路的影響 予PTEN特異性抑制劑SF1670處理后，PTEN蛋白水平顯著下調，p-Akt蛋白水平明顯增加（P＜0.05），總Akt蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 PTEN抑制劑對PI3K/Akt信號通路的影響

2.4 linc00346和PTEN對T24細胞增殖的影響 沉默linc00346表達后，與Control組對比，shRNA組T24細胞的增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05），Scramble組細胞增殖無顯著變化（P＞0.05），見圖5A。給予PTEN抑制劑SF1670處理后，PTEN inhibitor組細胞的增殖能力明顯增強（P＜0.05），見圖5B。

圖5 linc00346和PTEN對T24細胞增殖的影響

3 討論

LncRNAs具有序列長、攜帶遺傳信息豐富、可折疊形成復雜空間結構等特點，從而能夠參與多種分子調控機制，包括細胞周期、細胞分化、細胞凋亡、免疫監視等諸多關鍵環節[4-5]。linc00346位于人類13號染色體長臂3區4帶，有研究報道其與小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸道腫瘤等多系統惡性疾病的發生密切相關[6-7]。我們的前期研究結果證實，linc00346在膀胱尿路上皮癌組織及細胞中異常高表達，并且能夠影響膀胱癌細胞的增殖、凋亡以及侵襲轉移等生物學行為[2]。PTEN是一種具有雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，主要通過參與PTEN/PI3K/Akt、PTEN/ERK、PTEN/FAK/P130cas以及p53/MDM2等多條信號傳導通路，發揮其抑制腫瘤細胞侵襲轉移、阻滯細胞周期、抑制腫瘤血管生成等負向調控效應[8]。

本研究中，我們通過RT-PCR檢測膀胱癌組織標本中linc00346和PTEN的相對表達量，驗證了膀胱癌組織中存在linc00346高表達、PTEN低表達現象。應用慢病毒載體介導的shRNA靶向沉默膀胱癌T24細胞系中linc00346的表達后，Western blot檢測發現PTEN蛋白水平升高，PI3K/Akt通路中的關鍵蛋白p-Akt水平下調，總Akt蛋白保持不變，而經PTEN抑制劑處理后，p-Akt蛋白水平增加，證實了PTEN對PI3K/Akt通路的直接負性調控效應。CCK-8實驗結果發現，PTEN水平升高可以抑制膀胱癌細胞的增殖能力，提示linc00346可以通過PTEN調控PI3K/Akt通路來影響腫瘤細胞增殖。

PI3K/Akt是一條蛋白激酶偶聯受體介導的信號傳導途徑，與細胞增殖、凋亡及細胞周期等生物學過程密切相關，在多種惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[9]。PTEN同時具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶活性，被稱為雙重特異性磷酸酶[10]。PTEN正是利用其脂質磷酸酶活性，使磷脂酰肌醇（3，4，5）三磷酸（PIP3）脫磷酸生成PIP2。PIP3是PI3K的代謝產物，介導了Akt的活化過程，因此，PTEN可以通過降低PIP3的水平，減弱PI3K和Akt活化，抑制PI3K/Akt信號通路，最終達到加速細胞凋亡、阻滯細胞周期、抑制腫瘤細胞侵襲轉移等抑癌效應[8，11-12]。據文獻[13-14]報道，53%的原發性膀胱癌患者PTEN蛋白表達降低甚至缺失，94%的晚期膀胱癌中PTEN蛋白表達水平明顯降低，提示PTEN基因缺失或受到抑制與膀胱癌的發生、進展密切相關。

綜上所述，linc00346在膀胱癌組織及細胞系中高表達，并可能通過抑制PTEN表達而激活PI3K/Akt信號通路，最終加速膀胱尿路上皮癌細胞增殖。