克羅恩病患者經英夫利昔單抗治療后血管內皮生長因子-A的變化及其臨床意義

程海燕，沈哲

紹興第二醫院 消化內科，浙江 紹興 312000

克羅恩?。–rohn’s disease, CD）是一種可累及全消化道的慢性、反復發作和非特異性炎癥性疾病，其病變多見于末端回腸及其鄰近的結腸[1]，同時該病還常伴有皮膚、結節性紅斑及關節等部位的腸外表現。英夫利昔單抗是治療重度CD最早的一種生物制劑，其安全性和有效性已被證實[2]，C反應蛋白（C-reactive protein, CRP）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）是臨床上評估治療有效性的常用指標。盡管如此，CD的治療及療效評價仍有很多不足，需進一步研究CD的發病機制。有研究表明血管生成參與整個CD疾病的發生發展過程，其中血管內皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor, VEGF-A）在此過程中起重要作用[3]。當腸道黏膜受到缺氧、炎癥等刺激后，腸道內皮細胞、成纖維細胞、單核細胞、平滑肌細胞及活化的血小板產生大量的VEGF-A[4-5]。本研究主要檢測CD患者接受英夫利昔單抗治療后血清及病變腸道黏膜組織VEGF-A表達水平的變化。

1 資料和方法

1.1 患者資料 收集2016年1月至2020年9月紹興第二醫院消化內科收治的30例重度CD患者。英夫利昔單抗（商品名：類克，西安楊森公司）的治療劑量為5 mg/kg，在治療前及治療后6個月進行相關指標觀察，全部患者診斷符合2018年中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組推薦的標準[6]。同期選擇30例健康志愿者正常結腸黏膜標本及其外周血作為正常對照組。入選標準：①年齡12～70歲；②CD活動指數＞450，且隨訪超過6個月的患者；③治療前告知英夫利昔單抗的相關風險，并簽署知情同意書。排除標準：①資料不完整；②妊娠；③英夫利昔單抗治療＜6個月。同期選擇30例健康志愿者正常結腸黏膜標本及其外周血作為正常對照組。本研究納入對象均簽署知情同意書并取得我院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：首次給患者予英夫利昔單抗5 mg/kg，然后在首次給藥后的第2周和第6周及以后每隔8周各給予一次相同的劑量，給藥途徑為靜脈微泵注射。

1.2.2 療效評定：①顯效：腹痛腹脹等臨床癥狀消失，CRP、ESR下降到正常范圍，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍愈合，腸糜爛消失。②有效：腹痛腹脹等臨床癥狀消失，CRP、ESR下降，但仍高于正常范圍，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍縮小，腸糜爛減輕。③無效：腹痛腹脹等臨床癥狀無明顯減輕，CRP、ESR下降不明顯，腸鏡檢查提示腸黏膜潰瘍及腸糜爛無好轉，甚至加重。總體有效率=（顯效人數+有效人數）/總人數×100%。

1.2.3 酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）：分別抽取每位CD患者治療前、治療6個月后，及每位健康志愿者的靜脈血，置于促凝管中自然凝固后，1 000×g離心10 min，取血清保存于-80 ℃冰箱待檢。嚴格按照試劑盒說明書進行ELISA操作，用酶標比色計測定（OPD用492 nm）OD值，繪制標準曲線并計算血清樣本中VEGF-A含量。

1.2.4 散射光比濁法及魏氏法：分別抽取每位CD患者治療前、治療6個月后，及每位健康志愿者的靜脈血，予乙二胺四乙酸抗凝，散射光比濁法檢測CRP，魏氏法檢測ESR。該檢測結果由我院檢驗科提供。

1.2.5 免疫組化染色：每位CD患者治療前后分別取內鏡活檢病變腸黏膜標本2塊，內鏡下取每位健康志愿者正常腸黏膜2塊，40%甲醛固定后石蠟包埋，全部石蠟標本均行5 mm連續切片，放置在60 ℃恒溫箱中烘烤120 min，常規脫蠟，水化，3%甲醇過氧化氫孵育5～10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min重復2次，EDTA修復，正常羊血清室溫下封閉，加入即用型鼠抗人VEGF-A單抗，4 ℃冰箱過夜，PBS清洗，加入二抗，溫育0.5 h，沖洗后DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封片。

1.2.6 結果分析標準：陽性細胞所占的百分比＜25%記l分，26%～50%記2分，＞50%記3分；弱染色至中染色記1～4分，強染色記5分；將染色強度評分和陽性細胞率評分的乘積作為該切片的評分值，1～4分判定為低表達（+～++），≥5分判定為高表達（+++）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析。計數資料采用頻率、百分比表示，多組比較采用χ2檢驗。計量資料采用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 療效評定 30例CD患者經英夫利昔單抗治療6個月后，總體有效率統計見表1。

表1 CD患者治療6個月后療效評定（n=30）

2.2 血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較 ELISA檢測結果顯示，與治療前組比，治療后組血清VEGF-A、CRP、ESR水平明顯下降（P＜0.001）；治療后組血清VEGF-A、CRP高于正常對照組比，但ESR水平差異無統計學意義（P=0.521）。見表2。

表2 3組CD患者血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較（每組n=30，±s）

表2 3組CD患者血清VEGF-A、CRP、ESR水平比較（每組n=30，±s）

與治療前組比：aP＜0.05；與正常對照組比：bP＜0.05

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2.3 腸道黏膜VEGF-A的表達強度比較 免疫組化檢測結果顯示，組間腸黏膜VEGF-A表達強度差異有統計學意義（χ2=48.39，P＜0.001）；治療后組CD患者腸道黏膜組織VEGF-A表達強度明顯低于治療前組（χ2=21.70，P＜0.001），治療后組高于正常對照組（χ2=5.82，P=0.016）。見表3、圖1。

圖1 3組腸黏膜VEGF-A表達的免疫組化檢測結果（×200）

表3 3組腸黏膜組織VEGF-A表達比較[每組n=30，例（%）]

2.4 CD患者血清VEGF-A表達水平與CRP、ESR的相關性 治療前組CD患者VEGF-A水平與CRP之間呈正相關（r=0.727，P＜0.001），與ESR之間呈正相關（r=0.450，P=0.013）；治療后組VEGF-A水平與CRP之間無相關性（r=0.158，P=0.405），與ESR之間不相關（r=0.172，P=0.363）。見圖2。

圖2 CD患者治療前后血清VEGF-A分別與CRP、ESR相關性散點圖

2.5 CD患者血清VEGF-A表達水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達強度的相關性 治療前CD患者血清VEGF-A表達水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達強度呈正相關（r=0.714，P＜0.001），治療后CD患者血清VEGF-A表達水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達強度亦呈正相關（r=0.926，P＜0.001）。見圖3。

圖3 CD治療前后血清VEGF-A與腸黏膜VEGF-A相關性散點圖

3 討論

大量臨床實踐發現英夫利昔單抗誘導CD緩解、對腸黏膜愈合及肛瘺管的愈合效果良好，能有效提高患者生活質量[7]。近年來有研究表明CD與免疫應答異常有關[8-9]，英夫利昔單抗是人工合成的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）抗體，可以與TNF-α結合并中和血漿中的 TNF-α，從而阻斷免疫反應的相關環節，誘導疾病緩解，降低激素的使用劑量，有利于瘺管閉合，可促進黏膜修復。CD除了與免疫應答異常有關，還有研究發現，腸道炎癥與VEGF-A密切相關。如ALGABA等[10]研究發現在實驗性結腸炎小鼠受累的炎性腸段中，黏膜下血管數量增多，并檢測到VEGF-A及其受體高表達；SCALDAFERRI等[11]發現在結腸炎的小鼠中，抑制VEGF-A表達對改善小鼠腸道癥狀明顯有效，同時能抑制黏膜炎癥細胞因子的產生；TOLSTANOVA等[12]通過研究3種實驗性動物模型，均發現抗血管生成因子內皮他丁對病變鼠的腸道有保護作用。在臨床研究中，有學者發現在活動期潰瘍性結腸炎患者的血清和血漿中，VEGF-A的表達水平均明顯升高，并且檢測到其受體VEGF-1的表達也增加[13]。STRUNK等[14]發現銀屑病和類風濕關節炎患者用英夫利昔單抗治療后能顯著降低血清中VEGF-A的表達水平。

為此，本研究探討CD患者通過英夫利昔單抗治療后是否也存在VEGF-A的表達水平的改變，治療前后表達量發生改變的VEGF-A是否能作為評估CD治療有效性的指標。本研究結果首先發現，30例CD患者經英夫利昔單抗治療6個月后，從腹痛腹脹等臨床癥狀的緩解，到CRP、ESR化驗室檢測結果的下降，再到腸鏡下黏膜愈合情況的總體有效率均高達75%以上。這與陳白莉等[15]研究發現英夫利昔單抗在治療中-重度潰瘍性結腸炎8周后的臨床有效率達64%，黏膜愈合率達34%結果相似。其次還發現，在CD患者治療前，患者血清中及病變腸道組織VEGF-A的表達水平相對較高，經英夫利昔單抗治療6個月后，患者血清及病變腸道組織VEGF-A的表達水平明顯下降，提示英夫利昔單抗能顯著降低血清及腸道黏膜中的VEGF-A水平，可推測阻斷VEGF-A調節血管生成的通路有利于炎性反應的緩解。與健康對照組比，治療后組血清中VEGF-A表達水平明顯升高。與治療后組比，CD治療前血清及腸道黏膜中的VEGF-A水平明顯升高，可推測VEGF-A參與了CD的發生、發展。近年來研究認為CRP、ESR對CD的治療效果有較高的預測價值[16]，本研究發現，CD患者接受英夫利昔單抗治療后血清CRP及ESR表達水平均較治療前明顯下降，提示本研究入選患者經英夫利昔單抗治療后是有效的。同時本研究對CD患者的血清VEGFA表達水平與CRP、ESR檢測結果進行了相關性分析，發現CD患者治療前組VEGF-A水平與CRP之間呈正相關，與ESR之間也呈正相關，說明血清VEGF-A水平隨CD病情加重呈正相關，這與DI SABATINO等[17]研究發現，CD患者經有效治療后VEGF-A水平明顯下降的結果一致。CD患者血清VEGF-A表達水平與腸道黏膜組織VEGF-A表達強度的相關性分析結果發現，CD患者治療前血清VEGF-A表達水平與治療前腸道黏膜組織VEGF-A表達強度呈正相關，CD患者治療后血清VEGF-A表達水平與治療后腸道黏膜組織VEGF-A表達強度也呈正相關。由此可推出治療前后發生改變的VEGF-A可能是評估CD療效的指標。盡管目前對于VEGF-A信號通路的作用機制尚不清楚，但本研究推測阻斷VEGF-A信號通路將是治療CD的潛在靶點以及VEGF-A有可能作為一個評估療效的指標，進一步研究VEGF-A信號通路將有利于對CD發病機制更深入的探索。