阿魏酸通過調控線粒體凋亡抑制宮頸癌HeLa細胞侵襲遷移功能

夏露，黃敏，梅潔，顏林志

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 婦科，浙江 溫州 325027

宮頸癌是影響婦女健康的四大常見癌癥之一[1]。據估計，每年有超過31.1萬人死于宮頸癌，其中85%以上的死亡發生在不發達國家。我國宮頸癌的發病率和病死率居高不下，宮頸癌的主要治療方法包括放射治療和化療[2]，但放化療的療效有限，患者預后不佳。研究人員不斷尋找含有低毒和廣泛抗癌活性的植物衍生化合物的替代抗癌療法[3]。阿魏酸（ferulic acid, FA）是一種羥基肉桂酸，是蔬菜和水果中含量豐富的酚類植物化學物質，具有抗氧化和抗腫瘤的生物活性。之前研究表明FA是一種有效的抗氧化劑，通過降低氧化應激來保護DNA免受氧化損傷，防止脂質過氧化[4]。FA可誘導許多腫瘤細胞毒性，如人骨肉瘤細胞、人膠質母細胞瘤細胞和前列腺癌細胞[5-6]。此外，之前的研究還發現FA可以誘導癌細胞發生凋亡[7]。然而，關于FA對宮頸癌的抗癌作用報道甚少。本文研究FA對宮頸癌HeLa細胞株的影響，并探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料與主要儀器 HeLa人宮頸癌細胞系來源于美國ATCC，購自BeNa Culture Collection（北京），胎牛血清以及高糖DMEM培養基購自美國Gibco公司，FA購自黃石飛云制藥有限公司，用高效液相色譜法測定FA純度為≥99.5%，并溶于二甲基亞砜（DMSO）中，4 ℃儲存。DMSO購于美國Sigma公司。細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8, CCK-8）試劑盒購于日本同仁公司。實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）相關試劑購自北京TaKaRa公司。Transwell小室及培養板購自美國Corning公司。MitoTracker購自美國Invitrogen公司。JC-1染色試劑盒購自北京索萊寶公司。基質膠購自美國BD公司。倒置生物顯微鏡購于德國徠卡公司。Bio-Rad 550酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖測定：為評價FA對HeLa細胞增殖活性的影響，將細胞（3×103個/孔）接種于96孔板中，在100 μL的完全生長培養基中培養24后，細胞以不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理，24 h后用PBS清洗各個孔中的細胞。隨后在每孔中加入100 μL PBS+10 μL CCK-8溶液，培養板在37 ℃下避光孵育1 h；control組的孔中加入100 μL PBS+10 μL CCK-8溶液。取出培養板，用全自動酶標儀在波長450 nm處測定每孔的吸光度，并計算各孔的細胞增殖活性。每個樣品每次含有2個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。細胞增殖活性=[（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（control組吸光度-空白組吸光度）]×100%。

1.2.2 RT-qPCR檢測凋亡相關基因的表達：不同濃度FA（1、2和4 mmol/L）處理HeLa細胞24 h后，用TRIzol試劑從各組HeLa細胞中提取總RNA。然后使用PrimScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser將該mRNA反轉錄成cDNA。以該cDNA為模板進行RT-qPCR分析。引物序列來源于NCBI的GenBank數據庫，見表1。對于RT-qPCR反應，20 μL的反應體系由10 μL Tli RNAseH Plus，0.8 μL的正向引物和0.8 μL的反向引物，6.4 μL的去RNA酶水以及2 μL cDNA組成。反應條件在95 ℃下反應3 min，1個循環，然后再進行40個循環。特定引物對的Tm為30 s，然后使用熱循環儀進行1個循環，分別為95 ℃下5 s、62 ℃下34 s和95 ℃下15 s。以β-actin作為內對照基因。結果用2-ΔΔCT方法進行分析，每個樣品每次含有2個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

表1 RT-qPCR所用的引物序列

1.2.3 線粒體標記（Mitotracker）染色：將接種于12孔板上的HeLa細胞用不用濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理24 h后，用PBS輕柔清洗3遍。隨后每孔中加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3遍，加入0.1% Triton通透10 min，PBS清洗3遍。最后將Mitotracker熒光染料加入到各個孔中，常溫避光孵育2 h后，用PBS清洗3遍，洗凈多余染料，加入DAPI孵育5 min，用PBS清洗3遍，加入抗熒光淬滅劑封固。在熒光顯微鏡下觀察細胞線粒體。

1.2.4 線粒體JC-1染色：將HeLa細胞接種到6孔板上。待細胞粘附到板上后，向細胞中加入不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）處理24 h。隨后用PBS清洗3遍，每孔加入0.5 mL JC-1染色液，37 ℃下染色20 min，PBS清洗3遍后，加入0.5 mL培養基，熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位，綠色/紅色熒光強度比為線粒體活性及膜電位情況。

1.2.5 Transwell侵襲實驗：使用Matrigel Transwell小室（孔徑8 μm，康寧，美國）檢測細胞的侵襲能力。首先用不同濃度的FA（1、2和4 mmol/L）預處理HeLa細胞24 h，消化收集HeLa細胞，將大約1×104個細胞100 μL接種到上室。在底室中加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基600 μL作為化學誘導劑。孵育24 h后，用棉簽將殘留在上室的細胞擦拭，侵入下室的細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定15 min，然后用0.2%結晶紫染色20 min。在倒置光學顯微鏡下拍攝侵入的細胞，并從隨機選擇的6個區域計數細胞數量。

1.2.6 細胞遷移實驗：采用劃痕實驗觀察FA對HeLa細胞遷移能力的影響。用200 μL黃色槍頭尖端損傷已經融合的單層HeLa細胞，然后用PBS洗滌細胞2次，在新鮮培養基中孵育48 h，用倒置顯微鏡觀察0和48 h時同一損傷邊緣細胞向損傷處遷移的情況，并使用ImageJ軟件進行分析計算，劃痕面積比率（%）=（0 d劃痕面積-2 d的劃痕面積）/0 d的劃痕面積×100%。

1.3 統計學處理方法 使用SPSS22.0軟件進行分析。計量資料以±s表示。兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey’s Post-hoc檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FA對HeLa細胞增殖活性的影響 FA處理組作用24 h后，與control組（99.33%±0.84%）比，HeLa細胞的增殖活性隨著FA濃度的增加而下降，FA 1 mmol/L組為（87.31%±8.43%），FA 2 mmol/L組為（58.21%±2.54%），FA 4 mmol/L組為（29.40%±0.76%），不同濃度的FA處理組間HeLa細胞的增殖活性差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示FA對HeLa細胞的增殖抑制作用具有藥物劑量依賴性。同時觀察FA處理后HeLa細胞凋亡的形態學特征，發現細胞出現起泡、細胞收縮、核固縮和碎裂，表明細胞發生凋亡，見圖1。

圖1 FA對HeLa細胞形態的影響（光鏡）

2.2 FA對HeLa細胞凋亡的影響 隨著FA濃度增高，凋亡保護因子Bcl-2的表達水平相較于control組逐漸下降，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2A；FA處理組的凋亡促進因子Bax以及Cleavedcaspase-3的表達水平相較于control組逐漸升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2B和2C。說明HeLa細胞的凋亡水平隨著FA濃度的增加而上升，提示FA對HeLa細胞的促凋亡作用具有明顯的藥物劑量依賴性。

圖2 FA對HeLa細胞凋亡相關基因表達的影響

2.3 FA對HeLa細胞線粒體功能及活性的影響 隨著FA濃度增高，與control組比，FA處理組Mitotraker的熒光強度逐漸顯著減弱，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。這提示HeLa細胞的線粒體數量及功能隨著FA濃度的增加而減弱。與control組比，FA處理組的綠色/紅色熒光強度比逐漸降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖4。這提示FA可以通過調節線粒體的膜電位增加HeLa細胞的線粒體凋亡水平。

圖3 Mitotracker染色檢測FA對HeLa細胞線粒體的影響

圖4 JC-1染色檢測FA對HeLa細胞線粒體膜電位的影響

2.4 FA對HeLa細胞侵襲及遷移能力的影響Transwell侵襲實驗顯示，與control組比（154.00± 23.07）個，FA處理組的HeLa細胞的侵襲能力隨著藥物濃度的提高其侵襲數量逐漸降低，不同濃度的FA處理組間HeLa細胞的侵襲能力差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5。細胞劃痕實驗結果顯示，與control組劃痕面積比，FA處理組HeLa細胞隨著藥物濃度的提高其遷移降低，不同濃度的FA處理組間HeLa細胞的遷移能力差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖5 Transwell實驗檢測FA對HeLa細胞侵襲能力的影響

圖6 劃痕實驗檢測FA對HeLa細胞遷移能力的影響

3 討論

作為女性生殖系統常見的惡性腫瘤[8]，宮頸癌是全球第三大確診的癌癥類型，發病率高[9]。由于先進的醫療保健系統，發達國家的宮頸癌發病率在過去十年中有所下降[10]，但在發展中國家仍然很高[10]。盡管宮頸癌的發病機制尚不清楚，但研究人員普遍認為HPV感染與該病的發生發展密切相關。最近有研究報道，30歲以下女性的宮頸癌病死率有明顯的上升趨勢[11]。因此，明確宮頸癌發生發展的機制具有重要意義。

大量實驗結果表明FA具有廣泛的生物活性。然而，盡管已知FA的重要治療特性包括抗癌功能[5-6]，但此前鮮見關于FA對宮頸癌的抗癌作用研究。本研究遷移侵襲實驗結果表明，隨著FA濃度的增加，HeLa細胞的遷移和侵襲能力隨之減弱，這說明在FA的作用下，HeLa細胞基本的發生發展受到抑制，從而降低其復發和轉移的概率，并通過Bcl-2蛋白家族誘導線粒體介導的細胞凋亡。

細胞凋亡是一個受多種因素控制的復雜過程，如Bcl-2、Bax等。Bcl-2蛋白定位于線粒體膜、內質網和核膜，是一種有效的凋亡保護因子，已被報道可以減少細胞收縮、染色質凝聚和DNA切割[10-12]。Bax蛋白是Bcl-2家族的一員，被激活以應對壓力和損傷。所以，Bcl-2和Bax蛋白被認為是決定細胞能否進入凋亡過程的關鍵因素[13]。本研究發現FA可以通過增加Bcl-2的表達以及抑制Bax的表達來調節宮頸癌細胞的凋亡。同時Bcl-2家族的成員通過調節細胞色素C從線粒體向胞漿的釋放，在固有的凋亡途徑中發揮關鍵作用[14-15]。因此，通過對HeLa細胞中線粒體功能的探查，以及凋亡相關基因和蛋白的檢測，發現FA處理線粒體膜電位及線粒體功能遭到破壞，且凋亡相關基因和蛋白都顯著增加，從而促進了線粒體驅動的細胞凋亡，這表明FA可以通過調節線粒體功能以及凋亡相關基因，發揮其誘導細胞凋亡的作用。