GRP78蛋白在胃癌中的表達及作用

李素云， 袁靖哲， 李 玄， 孟星圻， 劉 軒， 鄧 靖， 賀修勝

(南華大學衡陽醫學院 1.應用解剖與生殖醫學研究所，2.臨床醫學專業，3.腫瘤研究所，4.預防醫學專業，湖南省衡陽市 421001)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人們的生命與健康。由于胃癌早期癥狀不明顯，所以多數胃癌患者就診時已為中晚期，且其療效欠佳，5年生存率低。研究表明，胃癌的發生發展與多種基因表達異常有關，蛋白質是基因的表達產物，可作為胃癌發生的診斷標志物。目前臨床用于判斷胃癌發生的標志物主要有CEA、CA72-4和CA19-9，但其特異性不高[1-2]。因此，篩選并鑒定胃癌早期診斷的分子標志物，尋找早期診斷的新方法，是胃癌早診斷、早治療、改善患者生活質量及提高5年生存率的關鍵。

葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)也稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白。GRP78蛋白高表達于多種腫瘤細胞中，參與腫瘤細胞增殖、免疫逃逸、轉移及血管新生等病理和病理生理過程，GRP78蛋白可作為腫瘤預后不良的標志物，但其在胃癌組織中表達情況及作用機制尚不清楚[3-4]。本研究觀察GRP78蛋白在胃癌組織中表達水平及其對胃癌細胞系增殖和遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 標本與細胞

胃癌標本48例，癌旁正常胃黏膜組織28例(癌旁5 cm以上)，均由南華大學附屬第一醫院病理科贈予。胃癌標本中高、中分化32例，低分化16例；伴淋巴結轉移胃癌組織26例，手術取材后立即放入液氮罐中保存，經甲醛固定，制成石蠟切片以備用。SGC-7901及GRP78-shRNA2-SGC-7901細胞株由腫瘤研究所保存。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養液購自HyClone公司；胎牛血清購自四季青公司；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購自Genview公司、DMSO購自Solarbio公司；EDTA購自Sigma公司；Lipofectamine2000脂質體購自Invitrogen公司；鼠抗人單克隆抗體GRP78購自Abcam公司；鼠抗人GAPDH多克隆抗體購于上海科敏生物科技有限公司；HRP標記羊抗鼠抗體購于武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測GRP78蛋白的表達

制作石蠟切片，免疫組織化學染色法分析GRP78蛋白在胃癌和癌旁組織中的表達。二甲苯和梯度酒精脫水處理切片；EDTA抗原緩沖液置微波抗原修復，PBS洗3次，每次5 min；3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶；3%牛血清白蛋白封閉；PBS清洗3次，每次5 min；一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min；二抗孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；DAB顯色。

1.4 MTT法檢測GRP78對胃癌細胞增殖的影響

用含10%胎牛血清1640培養基配成細胞液，每孔100 μL，約2 000個細胞接種至96孔板，設3個復孔；置37 ℃、5% CO2的恒濕培養箱中培養，分別于24、48、72、96、120 h后取出，每孔加20 μL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中，孵育4 h，棄孔內液體，每孔加160 μL DMSO，振蕩12 min，充分融解結晶；酶標儀490 nm波長處進行檢測，記錄結果。以增長率或者抑制率為縱坐標，時間為橫坐標，繪制出細胞生長曲線圖。

1.5 Transwell方法檢測GRP78對胃癌細胞侵襲遷移的影響

基質膠鋪板，制備細胞懸液，調整細胞水平至1×106/mL；接種細胞，取100 μL加至Transwell小室的上室，在下室中加600 μL完全培養液；置培養箱中培養48 h，取出小室，用棉簽擦去上室細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗1次，0.1%結晶紫染色20 min，PBS清洗1次，顯微鏡下觀察細胞穿過小孔情況，拍照并統計穿過的細胞數。

1.6 統計方法

2 結 果

2.1 各組GRP78蛋白陽性表達比較及其與臨床病理特征的關系

GRP78蛋白表達產物GRP78蛋白位于胞質，且在胃癌組織中GRP78蛋白較正常胃黏膜組織明顯增加(圖1)。其陽性表達率與胃癌的直徑、分化、淋巴結轉移、分期、復發有關(P<0.05；表1)。

表1 胃癌組織中GRP78蛋白表達與臨床病理特征分析 單位：例(%)

圖1 免疫組化檢測GRP78蛋白在不同胃癌組織中的表達情況(結晶紫染色，40×)A為正常胃黏膜；B為癌旁組織；C為胃轉移癌；D為高分化胃癌組織；E為中分化胃癌組織；F為低分化胃癌組織。

2.2 GRP78蛋白對SGC-7901細胞增殖能力的影響

與SGC-7901組比較，GRP78-shRNA2組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，即下調GRP78蛋白能抑制SGC-7901胃癌細胞的增殖能力(圖2)。

圖2 MTT檢測GRP78-shRNA2質粒轉染后對SGC-7901細胞增殖能力的影響a為P<0.05,與SGC-7901比較。

2.3 GRP78蛋白對SGC-7901細胞遷移能力的影響

GRP78-shRNA2組遷移細胞數顯著低于SGC-7901組(P<0.05；圖3)，即下調GRP78蛋白表達能降低SGC-7901胃癌細胞的遷移能力。

圖3 Transwell檢測GRP78低表達對SGC-7901胃癌細胞遷移能力的影響A為結晶紫染色(40×)；B為遷移細胞數直方圖。a為P<0.05,與SGC-7901比較。

3 討 論

近年來，應用微陣列及比較基因組雜交等技術對胃癌細胞DNA或mRNA進行了研究，明確了部分與胃癌發生發展相關的基因[2]。蛋白質是生命功能活動的執行者，基因經轉錄翻譯成蛋白質后，還將進行折疊或修飾才能發揮其功能，因此，從基因水平不能全面反映出胃癌細胞內蛋白質變化。隨著蛋白組學和分子生物學技術的不斷發展，研究腫瘤發生發展相關蛋白質分子，為尋找胃癌早期診斷標志物奠定了基礎[5]。

葡萄糖調節蛋白78以分子伴侶形式參與蛋白質折疊與轉運，附著在內質網上，屬于應激蛋白，缺氧和低糖環境呈高表達狀態[6]。研究發現，GRP78蛋白高表達于肝細胞癌、結直腸癌、胃癌等腫瘤細胞中，其蛋白的高低可作為腫瘤預后不良的標志物，且GRP78蛋白在腫瘤細胞化療耐藥中發揮著關鍵作用[7-8]，GRP78蛋白是通過何種機制參與這些腫瘤的發生發展尚不清楚，但GRP78蛋白在多種腫瘤高表達，提示GRP78蛋白在腫瘤發生發展中可能扮演著重要角色。GRP78蛋白通過多種信號通路，廣泛參與了腫瘤細胞增殖、凋亡抵抗、免疫逃逸、轉移和血管新生等病理和病理生理過程[9]。有研究報道，GRP78蛋白對細胞的凋亡具有抑制作用，并經過未折疊蛋白反應(UPR)，使細胞數量增多[10]。腫瘤細胞表面GRP78蛋白是腫瘤信號轉導和活性的重要調節劑，能快速激活細胞表面其他蛋白受體或配體，能通過磷酸肌醇Ⅲ激酶/Akt信號通路，調控腫瘤細胞增殖和侵襲遷移[11-13]。然而，有關GRP78在胃癌組織中表達的臨床病理意義及其在胃癌轉移中的作用機制尚不清楚。

本研究運用免疫組織化學技術檢測胃癌組織中GRP78蛋白的表達水平，并分析其與胃癌轉移、臨床分期和病理分型等臨床指標，結果表明GRP78蛋白高表達于胃癌組織中，其表達與胃癌的直徑、分化、淋巴結轉移、分期、復發等有關。課題組前期成功建立了GRP78-shRNA2-SGC-7901胃癌細胞株[14]，通過MMT檢測GRP78蛋白低表達時對SGC-7901細胞增殖能力的影響；Transwell結果表明，降低GRP78蛋白表達能抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖和遷移能力。綜上，GRP78蛋白可能參與了胃癌的發生發展，但其具體作用機制還需進一步研究。