晚期NSCLC組織巨噬細胞表面Tim-3表達與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

籍 強， 呂駿卿， 趙 鑫， 榮偉強

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.胸心血管外科，2.急診科，3.放療科，4.輸血科， 河北省張家口市075000)

中國肺癌致死率一直高居首位，主要與早期確診率較低且治療手段有限有關(guān)，近年來免疫檢查點分子的發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療提供了新的思路[1]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)指南(NCCN)建議，對于轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)患者可優(yōu)先選擇免疫檢查點抑制劑作為二線治療方案[2]。2018年，James團隊因證實阻斷免疫檢查點-細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programed cell death protein-1，PD-1)可激活機體自身抗腫瘤免疫應(yīng)答而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎[3]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，Tim-3)也是本世紀初新發(fā)現(xiàn)的一個免疫檢查點分子，在多種免疫細胞表面和實體腫瘤細胞表面都有表達；通過與其相應(yīng)配體半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)結(jié)合介導(dǎo)腫瘤負向免疫調(diào)節(jié)[4]。但是目前關(guān)于Gal-9和Tim-3與肺癌關(guān)系的研究尚不全面，本研究旨在檢測晚期NSCLC組織、腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)表面Tim-3表達情況，及與組織Gal-9表達、患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，為Tim-3/Gal-9在腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答機制研究提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2017年4月—2018年5月本院病理科保存的80例晚期NSCLC患者的病理組織蠟塊，男62例，女18例，年齡34～79歲，平均(60.41±13.95)歲。納入標準：①病理證實原發(fā)性NSCLC；②TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期；③不具備手術(shù)指征；④患者簽署知情同意書。排除標準：①小細胞肺癌或非原發(fā)NSCLC；②曾接受相關(guān)抗腫瘤治療；③合并其他肺部良性病變、其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病。另外同期選取本院30例肺良性病變手術(shù)患者的肺組織蠟塊，男17例，女13例，年齡28～75歲，平均(58.37±15.72)歲；包括肺大皰17例，肺結(jié)核11例，支氣管擴張2例；均未合并惡性腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病。治療結(jié)束后開始電話、規(guī)律復(fù)診等隨訪1次/月，共隨訪24個月。研究終點為總生存期，即患者從確診當日至隨訪截止時間2020年3月或死亡，隨訪終點死亡患者共58例(72.5%)。

1.2 主要試劑和儀器

DAB染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記的兔抗羊(或鼠)二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)。鼠抗人多克隆抗體Gal-9、兔抗人多克隆抗體Tim-3(美國Abcam公司)；FITC-CD68(巨噬細胞表面標志物)、PE-HLA-DR、PE-163、PeCy5-Tim-3(美國Thermo Fisher公司)；Precipoint-M8型全自動數(shù)字病理切片掃描儀(德國Proteintech公司)；光學(xué)倒置顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

取石蠟切片，65 ℃烘烤融蠟，常規(guī)脫蠟水化。將切片放入預(yù)熱的檸檬酸鈉組織修復(fù)液中，高溫高壓煮沸3 min，自然冷卻至室溫；滴加3%雙氧水和山羊血清避光封閉30 min；滴加Tim-3一抗(1∶100稀釋)或Gal-9一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；陰性對照采用PBS代替抗體；滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊(或鼠)二抗；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸-酒精返紅，氨水返藍，脫水晾干后用中性樹膠封片。結(jié)果判斷由兩位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)生盲法閱片，鏡下顯示胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色即為陽性染色。參考文獻[5]，將陽性染色細胞百分比對應(yīng)分值×染色強度作為評分標準，每張切片隨機取10個高倍視野(400×)。>1分為陽性表達，0～1分為陰性表達。

1.4 流式細胞術(shù)檢測TAM表面Tim-3表達

取NSCLC患者新鮮腫瘤組織，無菌條件下剪碎消化，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。收集細胞懸液反復(fù)洗滌，加入Ficoll單個核細胞分離液，取中間絮狀物反復(fù)洗滌。加入熒光標記的FITC-CD68、PE-CD163/或PE-HLA-DR和PeCy5-Tim-3避光孵育15 min，上機檢測。HLA-DR是M1型巨噬細胞標志物，而M2型巨噬細胞可高表達CD163，因此將HLA-DR+TAM視為M1型，將CD163+TAM視為M2型。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組組織Tim-3和Gal-9蛋白表達的比較

Gal-9和Tim-3蛋白多表達于胞膜和胞質(zhì)中，偶見胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)。NSCLC組織中Tim-3和Gal-9蛋白陽性表達率分別為55.0%和83.75%，肺良性病變組織中分別為33.3%和20.0%；NSCLC組織高于肺良性病變組織(χ2=4.098，P=0.043；χ2=39.718，P=0.000)。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測肺組織Tim-3和Gal-9蛋白陽性表達情況(400×)

2.2 NSCLC組織TAM表面Tim-3蛋白的表達

流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，HLA-DR+TAM表面Tim-3陽性表達率低于CD163+TAM[(18.55±6.17)%比(32.56±8.43)%，t=14.369，P=0.000]。將表達率≤平均值視為低表達，>平均值視為高表達，80例NSCLC患者中，HLA-DR+TAM表面Tim-3蛋白呈高表達32例，CD163+TAM表面Tim-3蛋白呈高表達45例。

2.3 NSCLC組織Gal-9表達與組織Tim-3蛋白、TAM表面Tim-3蛋白表達的關(guān)系

NSCLC組織Gal-9蛋白和Tim-3蛋白表達一致率為63.75%(51/80)，經(jīng)Spearman等級相關(guān)性檢驗，NSCLC組織Gal-9蛋白和Tim-3蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.283，P=0.011)。NSCLC組織Gal-9陽性表達者HLA-DR+TAM和CD163+TAM表面Tim-3表達量均高于陰性表達者(P<0.05；表1)。

表1 NSCLC組織Gal-9表達與組織Tim-3蛋白、TAM表面Tim-3蛋白表達的關(guān)系

2.4 NSCLC組織TAM表面Tim-3蛋白表達與臨床特征的關(guān)系

有肺外轉(zhuǎn)移、TNM-Ⅳ期和死亡患者HLA-DR+TAM表面Tim-3表達量分別低于無肺外轉(zhuǎn)移、TNMⅢ期和存活患者，而CD163+TAM表面Tim-3表達量則分別高于無肺外轉(zhuǎn)移、TNMⅢ期和存活患者(P<0.05；表2)。

表2 不同TAM表型Tim-3蛋白表達水平與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系 單位：%

2.5 不同TAM表型Tim-3蛋白表達與OS的關(guān)系

NSCLC患者總生存期為17個月(4～30個月)，HLA-DR+TAM表面Tim-3蛋白高表達患者總生存期長于低表達患者(Log-rank χ2=8.817，P=0.003)；CD163+TAM表面Tim-3蛋白高表達亞組患者中位總生存期則短于低表達亞組(Log-rank χ2=10.913，P=0.001；圖2)。

圖2 NSCLC患者Kaplan-Merier生存曲線圖

3 討 論

近年來，免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)為晚期NSCLC患者帶來了新的希望[1]，目前國內(nèi)已批準上市多種PD-L1抗體和PD-1抗體，被指南納入用于晚期NSCLC的一線、二線、三線治療[6]。雖然免疫檢查點抑制劑在晚期NSCLC患者中的有效性和安全性已得到眾多研究證實，但是其適用人群有限。Koyama等[7]發(fā)現(xiàn)，對于PD-1抗體耐藥的小鼠肺癌模型中，體內(nèi)T細胞表面Tim-3分子的表達量顯著提高，而給予小鼠Tim-3抗體后，可明顯提高模型小鼠對PD-1抗體的敏感性，因此推斷Tim-3有望成為免疫治療新的靶點。本研究納入的中晚期NSCLC患者均不符合手術(shù)指征，遵醫(yī)囑接受免疫治療聯(lián)合化療，接受PD-1抗體單獨治療的患者極少，多數(shù)患者采用聯(lián)合化療方案，因此本研究納入的80例患者均為接受化療聯(lián)合Nivolumab單抗，通過評估患者2年生存期發(fā)現(xiàn)，TAM表面Tim-3分子的表達情況與患者預(yù)后密切相關(guān)。

Tim-3屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，除了表達于T細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞表面以外，亦存在于巨噬細胞和腫瘤細胞表面[8]。本研究通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，中晚期NSCLC組織中Tim-3和Gal-9均呈高表達。Gal-9是Tim-3最重要的天然配體之一，Wang等[9]發(fā)現(xiàn)Tim-3/Gal-9信號通路可通過調(diào)控細胞因子分泌和巨噬細胞極化參與腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移。TAM是腫瘤微環(huán)境中十分重要的免疫細胞，具有高度可塑性，既包含M1型巨噬細胞，也包含M2型巨噬細胞，而TMA表型的動態(tài)變化也是影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。M1型巨噬細胞(即HLA-DR+TAM)具有抗腫瘤和免疫增強作用，可分泌趨化因子、效應(yīng)因子等；而M2型巨噬細胞(即CD163+TAM)具有抑制免疫反應(yīng)、促進血管發(fā)生、組織修復(fù)和促進腫瘤生長的潛能。例如王位等[10]發(fā)現(xiàn)，在炎癥環(huán)境中促炎因子或抑炎因子都可影響巨噬細胞表面Tim-3分子的表達情況。張倩倩等[11]提出TAM浸潤與肺腺癌腫瘤TNM分期、Ki67表達密切相關(guān)，其作用機制與肺內(nèi)炎癥微環(huán)境有關(guān)。Li等[12]研究表明在膠質(zhì)瘤患者中，外周CD14+單核細胞表面Tim-3呈高表達，而且可促進單核細胞向M2型極化。本研究通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，HLA-DR+NTAM表面Tim-3陽性表達量低于CD163+TAM，但是Tim-3表達量和M2型巨噬細胞分化的因果關(guān)系尚不能確定，有可能是M2型巨噬細胞分泌的炎癥因子促進Tim-3的陽性表達，也有可能是Tim-3高表達誘導(dǎo)TAM向M2型極化。但是無論如何，Tim-3陽性表達都與TAM向M2型巨噬細胞極化之間存在著密切關(guān)聯(lián)，在腫瘤細胞肺外轉(zhuǎn)移以及疾病進展過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此腫瘤組織巨噬細胞細胞表面Tim-3有望成為免疫治療的有效靶點，同時對于篩查PD-1/PD-L1免疫抑制劑敏感人群亦可提供可參考的信息。

綜上所述，在晚期NSCLC患者中，Tim-3和Gal-3在腫瘤組織中均呈高表達，Tim-3/Gal-3信號通路在NSCLC肺外轉(zhuǎn)移以及疾病發(fā)展中的作用可能與TAM向M2型巨噬細胞極化導(dǎo)致的肺癌炎癥微環(huán)境有關(guān)。而且對于接受PD-1抗體聯(lián)合化療的晚期NSCLC患者，Tim-3分子在HLA-DR+TAM表面降低且在CD163+TAM表面升高預(yù)示著患者2年生存預(yù)后不良。本研究為揭示Tim-3作為免疫負性共刺激分子在NSCLC抑制性免疫微環(huán)境形成過程中的作用，以及成為下一個用于臨床的免疫治療靶點的研究提供了新的思路。