二氫楊梅素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲

譚武鵬， 譚 雄， 伍菊花

(衡陽(yáng)市婦幼保健醫(yī)院婦科，湖南省衡陽(yáng)市421001)

卵巢癌(ovarian cancer,OC)是發(fā)病率為第三位的惡性婦科腫瘤，但其死亡率卻高居?jì)D科腫瘤的第一位[1]。卵巢癌的發(fā)病隱匿，早期的臨床癥狀不明顯，很多患者在發(fā)現(xiàn)并被確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期，因而預(yù)后并不理想[2]。細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)是導(dǎo)致OC治療失敗的重要原因，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAM)是腫瘤微環(huán)境的重要部分之一，與腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng)方式具有密切的關(guān)系[3]。二氫楊梅素(dihydromyrietin,DMY)是一種從植物中提取到的黃酮類(lèi)化合物[4]。DMY的藥理作用很廣泛，如抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫力等[5-6]。本研究擬觀察DMY處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并從PI3K/Akt/巨噬細(xì)胞極化信號(hào)途徑的角度探討其可能的機(jī)制，為卵巢癌的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海庫(kù)提供，RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。小牛血清購(gòu)自四季青生物科技公司。干擾素-γ(interferon gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(interleukin10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自漢恒生物科技公司。DMY購(gòu)自曼斯特生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞均用DMEM培養(yǎng)液(10%含小牛血清)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為RAW264.7細(xì)胞組(RAW組)、SKOV3細(xì)胞組(SKOV3組)、RAW264.7細(xì)胞+DMY組(DMY+RAW組)、RAW264.7細(xì)胞+SKOV3細(xì)胞組(RAW+SKOV3組)、DMY+RAW264.7細(xì)胞+SKOV3細(xì)胞組(DMY+RAW+SKOV3組)。RAW組和SKOV3組均用DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清)培養(yǎng)24 h；DMY+RAW組用DMY(60 mg/L)處理RAW264.7細(xì)胞24 h；RAW+SKOV3組用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)24 h；DMY+RAW+SKOV3組先用DMY(60 mg/L)處理RAW264.7細(xì)胞24 h，更換培養(yǎng)基，再將RAW264.7細(xì)胞和SKOV3細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK-8檢測(cè)SKOV3細(xì)胞增殖水平

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板。在處理結(jié)束后，取CCK8試劑溶液10 μL加到培養(yǎng)孔，靜置于室溫下4 h，然后在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中再繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用只含培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔進(jìn)行校正，把酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)調(diào)為450 nm，檢測(cè)各培養(yǎng)孔的光密度值(OD值)。

1.5 Transwell檢測(cè)SKOV3細(xì)胞的侵襲能力

將RAW264.7細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板，密度為1×105個(gè)/孔。取半透膜(孔徑為8.0 μm)放置到Transwell上室的底部。制備好基質(zhì)膠，取80 μL預(yù)先制備好的基質(zhì)膠，加入到Transwell的上室，置于37 ℃條件下過(guò)夜，使其固化。把SKOV3細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于Transwell的上室中，密度為3×105個(gè)/孔。再將Transwell小室置于已經(jīng)接種了RAW細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中，建立非接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后取出上室，將其浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定15 min。然后在0.1%結(jié)晶紫溶液中染色30 min。取出Transwell小室，擦干水分。顯微鏡下觀察結(jié)果，每個(gè)樣本隨機(jī)取視野5個(gè)，計(jì)數(shù)穿過(guò)了基質(zhì)膠的細(xì)胞。

1.6 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平

收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測(cè)IFN-γ、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用BCA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總蛋白水平，結(jié)果采用ng/g蛋白表示。

1.7 Western blot檢測(cè)PI3K和Akt蛋白的表達(dá)

提取巨噬細(xì)胞的總蛋白和核蛋白，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。通過(guò)BCA法檢測(cè)樣本的蛋白水平。取適量的總蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸充分變性蛋白。凝膠電泳分離蛋白后，電轉(zhuǎn)的方法把蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinyl fluoride,PVDF)膜上。將PVDF膜與脫脂牛奶在室溫下孵育2 h。加入兔抗人PI3K(1∶400)、p-PI3K(1∶300)、Akt(1∶500)和p-Akt(1∶500)的一抗，4 ℃過(guò)夜。Tris-Tween緩沖液洗膜3次，加入二抗，4 ℃下孵育4 h，Tris-Tween緩沖液洗膜3次。曝光、顯影、定影操作，使用圖像分析軟件掃描膠片。核蛋白檢測(cè)采用的內(nèi)參是組蛋白，其他內(nèi)參均是β-actin，對(duì)目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲能力的比較

與SKOV3組比較，RAW+SKOV3組SKOV3細(xì)胞的增殖水平及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高(P<0.05；圖1)。與RAW+SKOV3組比較，DMY+RAW+SKOV3組SKOV3細(xì)胞的增殖水平及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05；圖1)。

圖1 各組SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲能力的比較a為P<0.05，與SKOV3組比較；b為P<0.05，與RAW+SKOV3組比較。

2.2 各組培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子水平的比較

與RAW組比較，DMY+RAW組培養(yǎng)液上清中IFN-γ和TNF-α的水平顯著升高，而IL-10和TGF-β的水平顯著降低(均P<0.05；圖2)。

圖2 各組培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子水平的比較a為P<0.05，與RAW組比較。

2.3 RAW264.7巨噬細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白表達(dá)

與RAW組比較，DMY+RAW組RAW264.7細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05；圖3)。

圖3 RAW264.7巨噬細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白表達(dá)a為P<0.05，與RAW組比較。

3 討 論

OC是女性生殖系統(tǒng)中的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，具有較強(qiáng)的侵襲性[7]。腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤侵襲性的重要因素，TAM是實(shí)體瘤中腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[8]。DMY是一種從藤茶中分離出來(lái)的黃酮醇類(lèi)化合物[9]，藥理學(xué)功效廣泛，如殺菌、鎮(zhèn)痛、止咳和增強(qiáng)免疫力等[10]。DMY促進(jìn)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞凋亡，機(jī)制與上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)[11]。DMY能減少小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移瘤的瘤重和肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量[12]。本研究結(jié)果顯示DMY預(yù)處理RAW巨噬細(xì)胞，顯著降低RAW細(xì)胞誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲能力，這提示DMY可抑制TAM誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，但是其機(jī)制還不清楚。

巨噬細(xì)胞具有兩種不同的功能表型，即經(jīng)典活化(M1型)和替代活化(M2型)，被稱為巨噬細(xì)胞極化[13]。M1型巨噬細(xì)胞有促炎反應(yīng)和殺傷腫瘤細(xì)胞等作用。M2型巨噬細(xì)胞有抑制炎癥和促進(jìn)腫瘤侵襲等作用[14]。PI3K/Akt信號(hào)通路是調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的重要信號(hào)途徑[15-16]。本研究結(jié)果顯示DMY處理顯著升高共培養(yǎng)體系培養(yǎng)液中TNF-α和IFN-γ時(shí)，能降低TGF-β和IL-10水平。DMY顯著上調(diào)RAW巨噬細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)水平。這提示DMY可誘導(dǎo)RAW巨噬細(xì)胞向M1型極化，這可能是DMY抑制卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲的機(jī)制之一。

總之，DMY抑制TAM誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲，其機(jī)制與通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)TAM的極化有關(guān)，該研究將為卵巢癌的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。