前列腺癌患者Hedgehog信號通路相關蛋白的表達及其臨床意義

張建坤， 張 航， 錢亞娜， 李業山， 董立軍

(河北中石油中心醫院泌尿外科，河北省廊坊市 065000)

前列腺癌是男性尤其是老年男性常見的惡性腫瘤性疾病，早期篩查其術后復發高危人群，能夠有效降低其復發率。前列腺癌早期診斷的生物學指標也是目前臨床及基礎研究的重點。Hedgehog(Hh)信號通路已經被證實在胚胎發育、器官穩態維持等方面發揮重要作用[1]。近年來，通過對腫瘤治療靶點的深入研究，發現Hh信號通路對腫瘤細胞的惡性生物學行為具有顯著的促進作用[2]，因此，推測Hh信號通路可能是調控癌癥發生發展的重要分子機制。目前關于Hh信號通路與前列腺癌病情及預后關聯的研究開展較少，因此本研究通過檢測前列腺癌患者Hh信號通路Shh、Ptch和Gli1蛋白表達水平，分析其表達與前列腺疾病嚴重程度和預后的關系，為其臨床治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月—2016年1月經手術治療病理確診的前列腺癌患者90例，年齡51～83歲，均取前列腺癌組織及病灶周邊<3 cm癌旁正常組織。根據腫瘤標本組織鏡下癌細胞及間質的分化程度進行Gleason評分[3]。本研究獲得本院倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意。

納入標準：①首次確診并接受手術治療；②術前未經內分泌、放射治療等其他治療方式；③臨床資料完整。排除標準：①合并其他原發惡性腫瘤；②不配合相關治療；③術中標本污染。病例脫落標準：①拒絕隨訪；②隨訪期失聯；③隨訪期因其他因素導致死亡。

1.2 免疫組織化學測定Hh信號通路相關蛋白表達

前列腺癌樣本、癌旁正常組織樣本離體后，經10%中性甲醛固定48 h，石蠟包埋并4 μm切片。切片脫蠟水化后高溫高壓熱修復，3%雙氧水室溫封閉10 min，與Shh、Ptch和Gli1一抗孵育過夜后，二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min，DAB顯色。其后蒸餾水沖洗并蘇木精染色，用PBS代替一抗作為陰性對照。Shh、Ptch和Gli1蛋白在前列腺癌細胞的陽性表達均位于胞核、胞質，根據染色細胞百分率、染色強度對結果進行判讀。染色細胞百分率：著色細胞占計數細胞≤10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～100%為3分。染色強度：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。上述兩種得分的乘積為每張切片著色程度得分，≤1分為陰性(-)、2～3分為弱陽性(+)、4～6分為陽性(++)、>6分為強陽性(+++)，弱陽性、陽性、強陽性統稱為陽性。

1.3 生存時間的觀察

以術后次日作為隨訪起點，2020年1月1日或該時間點前患者死亡的時間點作為隨訪終點，采用門診復診、電話等方面進行隨訪，以血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)、影像學檢查等方法明確復發或轉移的時間間隔作為無進展生存時間或者總生存時間。

1.4 統計學方法

數據經SPSS 20.0軟件處理，計數資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗；生存結局影響因素的分析采用Cox回歸模型；生存時間比較采用Kaplan-Meier生存分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 前列腺癌組織、癌旁正常組織中Hh信號通路相關蛋白表達的比較

前列腺癌組織中Hh信號通路相關蛋白Shh、Ptch和Gli1的表達水平明顯高于癌旁正常組織(圖1)，說明前列腺癌伴隨著Hh通路相關蛋白高表達。

圖1 前列腺癌組織Hh信號通路相關蛋白表達(免疫組化，400×)

2.2 Hh信號通路相關蛋白表達與前列腺癌病理特征的相關性

不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表達的前列腺癌患者臨床TNM分期、Gleason評分、合并骨轉移的分布差異有統計學意義(P<0.05；表1)。

表1 Hh信號通路相關蛋白表達與前列腺癌病理特征的相關性 單位：例(%)

2.3 前列腺癌復發轉移影響因素的Cox分析

多因素Cox回歸分析顯示：臨床TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、Gleason評分>7分、合并骨轉移、Shh蛋白表達陽性、Ptch蛋白表達陽性、Gli1蛋白表達陽性分別是前列腺癌患者術后復發轉移的獨立危險因素(P<0.05；表2)。

表2 前列腺癌無進展生存期影響因素的Cox分析

2.4 Hh信號通路蛋白表達與前列腺癌患者無進展生存期的關系

根據前列腺癌組織中Shh、Ptch和Gli1表達情況，將患者按3種蛋白分別分為陰性組及陽性組。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，蛋白陰性組患者的無進展生存時間均顯著長于蛋白陽性組(圖2；P<0.05)，提示Hh信號通路蛋白(Shh、Ptch和Gli1)表達與患者無進展生存期呈負相關。

圖2 不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表達的前列腺癌患者無進展生存期的Kaplan-Meier曲線

3 討 論

前列腺癌是男性發病率最高的惡性腫瘤之一。前列腺癌經手術治療的療效較為理想，患者的5年生存率較高，但術后早期的復發轉移是導致患者總生存率下降的直接原因。因此，探索前列腺癌復發轉移的分子機制，發現前列腺癌早期診斷的生物學指標，對改善前列腺癌患者的預后具有重要意義。Hh信號通路是一種進化保守的通路，在脊椎動物和無脊椎動物的胚胎發育中起到重要作用，能夠調控傷口及組織愈合、維持細胞干性[4]。經典的Hh信號通路由Hh配體、2個跨膜受體(Ptch、Smo)、下游核轉錄因子Gli及一些中間傳遞分子組成；當Hh信號通路分子存在時,Ptch與Smo組成的受體復合物的空間構象發生改變,Ptch對Smo的抑制作用被解除后,Smo向細胞內呈遞信號,并將信號呈遞給轉錄因子Gli，激活后的轉錄因子Gli進入細胞核能夠促進目的基因的表達[5]。

通常情況下，Hh信號通路的活性較低[6]；在腫瘤細胞中，Hh信號通路參與了多種腫瘤在不同階段的發生發展過程。研究發現，當Hh通路激活時，可通過表達Shh、Ptch、Smo和Gli等多重組分，從而調控細胞的增殖、抑制細胞凋亡，最終促進腫瘤發展[7]。Li等[8]的研究指出Hh信號通路可調控卵巢癌細胞的生物學特性；Nitzki等[9]發現在橫紋肌肉瘤中存在Ptch的過表達；Dong等[10]則認為Gli1的激活是埃洛替尼耐藥在人非小細胞肺癌中的關鍵機制。研究發現，在人前列腺癌細胞中，Hh信號處于高度活躍狀態[11]。Hh在前列腺癌中的異常激活，說明其通路相關蛋白或與前列腺癌發生發展具有相關性。

本文通過對前列腺癌組織樣本進行分析，探究Hh信號通路關鍵蛋白表達和前列腺癌發病及預后的關系，驗證Hh相關蛋白是否能作為前列腺癌腫瘤標志物，從而幫助疾病的診斷和治療。本文研究發現，Hh信號通路相關蛋白(Shh、Ptch和Gli1)過表達與前列腺癌疾病的嚴重程度密切相關，經Kaplan-Meier生存分析，Hh信號通路相關蛋白表達較高的前列腺癌患者無進展生存時間短，本文研究結果證明Hh信號通路激活對前列腺癌患者具有不良影響，為后續前列腺癌的靶向治療提供新思路。Hh信號傳遞是通過靶細胞膜上的受體Ptch及Smo作用于核轉錄因子Gli1,從而引起靶基因的表達,發揮其生理作用。Hh激活不僅能作為前列腺癌預后不良指標，也是疾病的潛在治療靶點。目前，Hh信號通路抑制劑，如vismodegib和sonidegib，已被開發用于癌癥治療，特別是對難治性/晚期癌癥患者[12]。其中，Ross等[13]驗證了sonidegib在前列腺癌中的療效；此外，Hh信號通路抑制劑聯合化療或放療手段，也能有效提高前列腺腫瘤的體內外治療效果[14]。

綜上所述，本研究驗證了Hh信號通路激活及其相關蛋白高表達與前列腺癌患者不良預后緊密相關，Shh、Ptch和Gli1的表達能反應疾病的嚴重程度，從而作為前列腺癌患者不良預后的生物指標。