血漿環狀RNA hsa_circ_0004812在HBV相關性肝癌中的診斷價值

郭 靚， 趙 鑫， 強雪芹

(成都市第七人民醫院檢驗科，四川省成都市610213)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國常見消化道惡性腫瘤，在癌癥致死病因中排第二位[1]。慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導致肝纖維化、肝硬化和肝癌的主要原因之一[2]。由于早期肝癌臨床癥狀不明顯，且臨床常用診斷肝癌的血清生物標志物甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)和其他潛在血清生物標志物的診斷準確性不高，造成臨床上肝癌死亡率居高不下[3]。因此，臨床上亟需新的生物標志物來提高肝癌的早期檢測水平。

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是由反向剪接形成、具有共價閉環結構的一種單鏈RNA分子，大部分由外顯子反向剪接形成，少部分直接來自內含子環化。circRNA作為一種新的內源性非編碼RNA，已被證實在機體多種細胞內表達并能調節不同生理代謝過程，包括細胞生長和信號轉導[4]。此外，最新報道發現circRNA與多種不同疾病有關，且被認為是一種潛在的用于肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等多種癌癥診斷的新生物標志物[5-6]。因此，本研究旨在分析一個ID：hsa_circ_0004812(CircBase數據庫)的circRNA，作為一種潛在生物標志物，在HBV相關性肝癌中的診斷意義。

1 資料和方法

1.1 資料來源

選擇2018年8月—2019年10月在本院就診HBV相關性肝癌患者108例(肝癌組)、慢性乙型肝炎患者97例(肝炎組)、乙型肝炎肝硬化患者92例(肝硬化組)，設同期健康志愿者101例為正常對照組。肝癌組、肝炎組、肝硬化組間一般資料差異無顯著性(P>0.05)，具有可比性。該研究經過本院倫理審查委員會批準，并獲得所有參與者的知情同意。

納入標準：①年齡18～80歲，②病情未嚴重至進入重癥監護病房。正常對照組：①無HBV感染，②健康且無惡性腫瘤。慢性乙型肝炎：①有HBV感染，②無其他惡性腫瘤。乙型肝炎肝硬化：①有乙型肝炎病毒感染，②肝活檢確診，或診斷必須有兩份圖像報告(B超、計算機斷層掃描或磁共振成像)支持診斷為肝硬化。HBV相關性肝癌：①有HBV感染，②病理確診為肝癌，③術前無化療、放療、經動脈化療栓塞或消融治療。

1.2 實驗室指標檢測

上午空腹狀態下抽取靜脈血，3 000 r/min離心，分離出血漿樣本后于-80 ℃保存待測。采用東芝80型全自動生物化學分析儀測定總膽紅素(TBil)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)等肝功能生物化學指標，采用電化學發光法(ECLIA)測定甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)水平，所有步驟均嚴格按照操作流程進行。

1.3 總RNA提取

血漿樣本根據試劑說明書以TRIzolTMLS Reagent(ThermoFisher)提取樣本總RNA樣本。在異丙醇沉淀過程中，添加糖原(Ambion/Applied Biosystems，美國)作為共沉淀物(最終質量濃度為100 mg/L)以增強RNA沉淀。RNA樣品的純度和質量濃度由NanoDrop ND-1000(NanoDrop Technologies，美國)測定。RNA完整性通過變性瓊脂糖凝膠電泳進行評估。用RNAe R(Epicentre)消化每個樣品中的總RNA，去除線性RNA并富集circRNA。

1.4 實時定量PCR檢測hsa_circ_0004812表達

按照生產商反轉錄試劑盒說明書的操作步驟，以M-MLV反轉錄試劑盒(Thermo112Fisher)將血漿樣本中提取的總RNA樣本進行反轉錄。按照SYBR?Premix Ex-TaqTMII(Tli RNAeH Plus)和ROX Plus(Takara，日本)的試劑說明進行操作，在StepOneTM實時定量PCR系統(Applied Biosystems，USA)上進行qRT-PCR。hsa_circ_0004812正向引物:5′-GCC TGC TAC CAC CA-3′,反向引物:5′-TTG TCA CGC TCC CT-3′；內參U6正向引物:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,反向引物:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。以實時PCR的熔化曲線來評定其準確性。用2-△△Ct法計算各基因表達。靶基因的mRNA表達值以U6的mRNA表達值為標準進行相對定量。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 各組一般資料的比較

肝癌組、肝炎組和肝硬化組TBil、γ-GT、ALP、ALT、AST以及AFP水平與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05；表1)。

表1 各組間一般資料的比較

2.2 各組hsa_circ_0004812表達水平的比較

HBV相關性肝癌患者hsa_circ_0004812表達明顯高于正常對照組、肝炎組和肝硬化組(P<0.05；圖1)。

圖1 qRT-PCR檢測各組hsa_circ_0004812表達水平a為P<0.05，與正常對照組、肝炎組或肝硬化組比較。

2.3 血漿hsa_circ_0004812和甲胎蛋白診斷價值的比較

以hsa_circ_0004812和AFP為檢驗變量，分別以正常對照組、肝炎組以及肝硬化組作為狀態標量，以靈敏度為Y軸,以“1-特異度”為X軸分別繪制ROC曲線(圖2)。結果表明，hsa_circ_0004812和AFP聯合檢測靈敏度顯著高于各指標單獨檢測(P<0.05),且聯合診斷的AUC顯著高于各項指標單獨檢測(P<0.05),聯合診斷時，任一指標為陽性，即可診斷為HBV相關性肝癌(表2)。

表2 hsa_circ_0004812、AFP單獨及聯合檢測肝癌診斷價值的比較

圖2 AFP和hsa_circ_0004812的ROC曲線分析

3 討 論

在中國，大多數肝癌患者都存在乙型肝炎病毒相關的肝炎史，并引起機體內肝細胞的持續炎癥反應、肝細胞壞死和結節性再生等病理特征的長期反復出現[7]。而炎癥和肝硬化的同時存在造成肝癌的早期診斷更加困難，主要是由于HBV感染引起的肝細胞炎癥和肝細胞再生釋放了大量的細胞因子和生物標志物，其中就包括circRNA。研究表明，機體受到病毒感染后宿主細胞以及病毒產生大量circRNA，從而存在作為病毒感染的候選生物標志物的潛在可能性[8]。同時，circRNA還參與機體調節抗病毒免疫應答、病毒復制以及傳染病的發病機制[9]。因此，本研究將HBV相關性肝癌與HBV相關性肝硬化以及慢性乙型肝炎進行比較，以篩選出與HBV相關性肝癌高特異性的circRNA，從而排除肝硬化和慢性乙型肝炎中的異常circRNA。

與線性RNA不同，具有特殊環狀閉合結構的circRNA對核糖核酸酶不敏感，相比線性RNA更穩定。且有研究發現，circRNA在人體內的外泌體、唾液和外周血中廣泛富集,這使得circRNA作為一種很有前途的疾病分子標記尤其具有吸引力[10]。研究表明，circRNA在慢性乙型肝炎引起肝癌的發生和發展中起著重要作用[11]。Wong等[12]的研究已經證明了HBV circRNA在HBV患者的肝臟中異常高表達，占主導地位。Wang等[13]通過Meta分析報道了HBV相關性肝癌中circRNA的差異表達，并確定hsa_circ_101764可能在肝癌中起重要作用。最新報道發現，Yu等[14]通過應用微陣列技術和qPCR技術對HBV相關性肝癌患者血漿circRNA進行檢測，探討血漿circRNA是否能診斷HBV相關性肝癌，結果發現一種血漿circRNA組合(CircPanel，包括hsa_circ_0000976、hsa_circ_0007750和hsa_circ_0139897)，在區分肝癌與健康人群、乙型肝炎及肝硬化患者時，顯示出比臨床使用的血清生物標志物AFP更高的準確性，并且在診斷AFP陰性肝癌中表現良好。總之，這些研究結果提示血漿circRNA是一種慢性乙型肝炎發展過程中潛在的肝癌診斷生物標志物。

2018年，Zhou等[15]通過對慢性乙型肝炎患者肝組織中circRNA的差異表達譜進行分析。結果發現，與正常對照組相比，hsa_circ_0004812是慢性乙型肝炎中顯著上調的前十個circRNA之一。而巧合的是，最近Zhang等[16]研究表明hsa_circ_0004812在慢性乙型肝炎患者和乙肝病毒感染的肝癌細胞系中均表達上調，且進一步研究表明hsa_circ_0004812能通過海綿吸附抑制miR-1287-5p促進卵泡抑素相關蛋白1(FSTL1)表達，從而影響HBV誘導的免疫抑制。眾所周知，microRNA與惡性腫瘤的發生發展密切相關[17]，而多項研究已證明miR-1287-5p在包括胰腺癌、結直腸癌和乳腺癌等多種癌癥中作為抑癌因子發揮重要調控作用[18-20]。亦有研究表明，FSTL1作為促癌因子，能通過Akt/GSK-3β依賴的方式抑制細胞凋亡促進肝癌進展[21]。因此，有理由相信，肝癌細胞中可能存在hsa_circ_0004812/miR-1287-5p/FSTL1軸調控HBV誘導的免疫抑制，最終影響HBV相關性肝癌的進展。目前已有報道認為，circRNA可以通過海綿吸附抑制microRNA，或與RNA蛋白結合海綿吸附形成支架，從而調節原癌基因和/或抗癌基因表達，進而影響腫瘤的發生、發展[22]。有研究報道顯示，circular RNASMA-RCA5可能充當miR-17-3p和miR-181b-5p的吸附海綿，從而影響肝癌的凋亡、增殖、侵襲與遷移[23]。

本研究通過分析臨床資料及qRT-PCR實驗檢測血漿circRNA表達，證實了血漿circRNA(hsa_circ_0004812)在HBV相關性肝癌中的診斷意義。本研究結果表明，通過檢測血漿hsa_circ_0004812水平可以將肝癌與健康人群以及HBV相關肝炎、肝硬化患者區分開來。有研究通過利用miRanda中構建的miRNA靶向預測軟件和RNAhybrid數據庫，預測了hsa_circ_0004812與其靶向miRNA之間的相互作用[15]，提示circRNA可能通過調節microRNA或作為microRNA載體參與腫瘤的各種生物學過程。

目前，AFP被廣泛用于肝癌的診斷和監測[24]。因此，本文比較了hsa_circ_0004812與AFP對HBV相關肝癌的診斷意義。ROC曲線分析顯示AFP診斷準確率略高于hsa_circ_0004812。hsa_circ_0004812與AFP聯合診斷應用對肝癌患者有較好的鑒別能力。本研究結果提示血漿hsa_circ_0004812是診斷HBV相關性肝癌的一個潛在的標志物。

綜上所述，本研究發現血漿circRNA hsa_circ_0004812，可以區分HBV相關性肝癌與HBV肝炎、肝硬化和健康人群，其診斷性能與AFP相當，聯合檢測價值更高。hsa_circ_0004812可作為診斷HBV相關性肝癌的新標志物。另外，本研究仍存在一定的局限性。包括招募的HBV相關性肝癌患者樣本過少，需要更大規模和多中心的研究來證實。其次對肝癌患者中circRNA的內源性調控機制尚無探究，需要進一步的研究來確定circRNA的內部調控機制。