NLRP3炎性小體在骨質疏松中的研究進展

黎良盛，翁一杰 綜述 魏勁松 審校

廣東醫科大學，廣東 湛江 524000

隨著老齡化時代的到來，因骨質疏松癥而導致的骨折的發病率也會明顯的增高，人們對骨質疏松(OP)的關注度及研究深度逐年加深。2018年，我國OP患病率增加到29.16%，預測到2050年將會達到39.19%[1-2]。OP現在被認為是一種自身免疫和炎性疾病，OP患者往往伴隨著體內炎癥因子水平的變化，炎癥因子是一類主要由免疫細胞和相關細胞產生的高活性、多功能小分子蛋白質[3]。顯然，骨質疏松的過程涉及到大量的炎癥因子和炎癥信號通路，這表明炎癥與骨質疏松的發生之間存在一定的機制，有待進一步探討。

1 NLRP3炎性小體與細胞焦亡概述

1.1 NLRP3炎性小體 NLRP3炎性小體是NLRs蛋白家族中最典型的家族成員，包含PYD、NACHT和LRR 3個結構域，NLRP3激活可募集接頭蛋白(ASC)和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)形成名為“炎性小體”的多蛋白復合體[4-5]。研究表明，NLPR3炎性小體完整的激活需要經過兩個階段。第一階段是啟動階段，病原相關分子模式(PAMPs)或損傷相關分子模式(DAMPs)被識別后，導致炎性小體的成分前體產生或激活，如Pro-IL-18、Pro-IL-1β。常見的PAMP包括脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PGN)、病毒雙鏈RNA(dsRNA)等。DAMP包括錯誤折疊或聚集的蛋白質，代謝物和假體植入物的磨損碎片；第二階段是激活階段，即各組分(NLRP3、ASC、Caspase-1)組裝形成NLRP3炎性小體及將Pro-IL-1β和Pro-IL-18轉化為生物活性形式誘導炎癥，并裂解消皮素D(GSDMD)，在細胞膜上形成GSDMD集合孔，從而觸發細胞焦亡[6]。NLRP3可以被多種刺激激活[7]，可能的機制包括鉀離子外流[8]、線粒體DNA釋放[9]、線粒體功能障礙及活性氧(ROS)產生[10]、氯離子通道蛋白(CLICs)依賴的氯離子外流[11]、溶酶體破裂[12]、胞內鈣離子濃度改變[13]、NEK7是一種重要的蛋白質，介導NLRP3炎癥體的組裝和激活[14]。

1.2 細胞焦亡 細胞死亡可分為凋亡、壞死、焦亡、自噬性細胞死亡和其他形式的細胞死亡。細胞焦亡是一種新發現的炎性細胞程序性死亡，細胞焦亡主要由NLRP3炎性小體激活包括Caspase-1在內的多種Caspase介導。激活的Caspase-1特異性識別和切割引起細胞焦亡的Gasdermin D(GSDMD)[15]。細胞焦亡發生迅速，與細胞凋亡相比，伴隨著大量促炎因子的釋放。

2 炎癥與骨質疏松之間的關系

近年來，有很多研究表明炎癥因子與骨質疏松的發病有密不可分的關系[16-17]。NLRP3突變導致人源化小鼠的骨骼并發癥，包括發育遲緩、生長板發育不良和骨量減少[18-19]，NLRP3缺乏可以減輕這種情況下的小鼠的骨丟失[20]。在部分絕經后骨質疏松女性患者體內，白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子水平明顯增加[21]，并且阻斷絕經后婦女TNF-α或IL-1β會導致骨吸收標記物的表達減少[22]。有研究指出，體內炎癥因子含量升高是絕經后女性髖部骨密度下降的原因之一[23]，維生素C有抗炎作用，飲食中維生素C的攝入可以有效降低髖部骨折、骨質疏松和BMD丟失的風險[24]。然而研究還發現另外一種情況，即NLRP3通過炎癥依賴性和非依賴性機制介導骨溶解，破骨細胞中這種炎癥小體的基因激活會導致小鼠骨質減少，而不會改變IL-1β的產生和破骨細胞的數量，骨吸收增加與細胞骨架改變相關[25]。因此，在沒有高度炎癥的情況下，這種炎性小體也可以引起骨吸收。炎癥與骨質疏松的關系得到驗證，但是尚需進一步研究。

3 NLRP3與骨質疏松的基礎研究

3.1 破骨細胞與IL-1β IL-1β無疑是細胞焦亡的重要節點。IL-1在細胞焦亡的過程中會有相當大的升高。IL-1主要由巨噬細胞產生，研究表明，如果要拮抗炎癥因子引起的破骨細胞形成，就必須同時拮抗IL-1和TNF-α。一方面，IL-1能介導TNF-α對破骨細胞的誘導作用；另一方面，IL-1β與T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞上的IL-1β受體結合可促進RANKL的產生[26]，IL-1還能促進M-CSF的產生，并在RANKL存在的條件下促進破骨細胞的分化及其活化[27-29]；IL-1也能抑制破骨細胞凋亡[30]，破骨細胞壽命的延長可能是加速骨吸收的關鍵因素[31]。另外，ALIPPE等[20]認為在加速骨轉換的條件下釋放的骨降解產物激活了炎癥小體，并促進破骨細胞分化，這可能代表了一種骨溶解的正反饋機制。顯然，破骨細胞介導的骨質疏松與NLRP3之間關系密切。

3.2 成骨細胞與IL-1β 另一方面，IL-1對成骨細胞也有影響。GUO等[32]證明IL-1α能通過JNK和p38/MAPK通路誘導MC3T3-E1細胞活性下降，抑制成骨細胞分化。ZHANG等[33]證明了下調TLR4在成骨細胞中的表達，降低了IL-1、TNF-α的水平，從而抑制炎癥途徑。在骨質疏松模型中，接受卵巢切除的大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平顯著高于對照組大鼠[34]。很清楚的看到，IL-1β通過影響成骨細胞在炎癥引起的骨質疏松中起至關重要的作用。

3.3 NLRP3與細菌 NLRP3介導細菌誘導的細胞焦亡，并參與炎癥過程中的骨丟失[35]，許多細菌感染后通過NLRP3介導引起骨質疏松[36-37]。細菌導致NLRP3炎性小體增加時，Caspase-1途徑被激活，IL-1β和IL-18的表達水平上調，導致成骨細胞死亡[38]。NLRP3基因缺陷的小鼠不會受牙齦卟啉單胞菌感染導致牙齦病引起的牙槽骨丟失[39]。此外，在雌激素缺乏性骨質疏松癥中，未觀察到直接細菌感染，但NLRP3水平仍然升高，成骨細胞的成骨能力下降，并且當NLRP3炎癥小體被抑制或失活時骨質疏松癥也得到緩解[40]。因此可以得知，細菌導致的炎癥與骨質疏松的關系密不可分。

3.4 NLRP3與ROS的相互作用 ROS是由一些已知的NLRP3炎癥體激活劑產生的，它們是NLRP3炎癥體形成和激活的關鍵觸發因素[41]。最近的研究也表明，ROS在骨質疏松的發病機制中是重要的組成部分，它調節破骨細胞的分化，促進骨的吸收[42-43]。同時，衰老過程中過量產生ROS會激活NLRP3炎性小體，進而產生更多的ROS，從而加劇ROS的高水平狀態。在這種情況下，由于活性氧對破骨細胞的過度激活，導致過度的骨吸收，最終導致骨質疏松。一系列研究也表明，ROS可以通過刺激RANKL和TNF的表達來促進破骨細胞的生成[44-45]。另外，炎癥介質可刺激破骨細胞產生線粒體內大量ROS產生，激活NLRP3炎性小體，進而促進大量的IL-1β分泌，而IL-1β又可以進一步刺激核轉錄因子NF-κB，進一步促進炎癥小體的活化，從而加重炎癥反應[46]，加速骨質疏松進程。綜上，針對ROS在NLRP3對破骨細胞分化的影響對破骨細胞相關疾病具有治療潛力。

3.5 NLRP3炎性小體與衰老 NLRP3炎癥小體調節小鼠中與年齡相關的炎癥和骨溶解。靶向抑制炎性體成分可能會改善慢性炎癥和各種其他與年齡相關的疾病[47-48]。靶向抑制NLRP3炎癥小體可減少與年齡相關的骨丟失[49]。MODIC改變是退行性腰椎終板的MRI信號改變，其導致或加速椎間盤退變，與MRI未觀察到的椎體爆裂性骨折相比，有下腰痛和MODIC改變的患者軟骨終板組織中NLRP3和IL-1β的表達上調[50]。有意義的是，這是在人體組織中檢測到了NLRP3炎性體。因此可以說明NLRP3炎性小體在老年人中更體現出作用，NLRP3炎性小體對老年性骨質疏松具有深遠的研究意義。

4 NLRP3炎癥小體相關抑制劑

4.1 NLRP3炎性小體特異性抑制劑在骨質疏松上的應用 靶向抑制NLRP3炎性小體及其組分可能存在治療OP的作用。此時特異性地針對NLRP3的活化，可能會提供一種更為精確的降低炎癥損害的方法和減緩OP進程。許多研究表明，比如用ROS抑制劑NAC可以減輕ROS介導的細胞焦亡[51]；MCC950特異性抑制NLRP3的激活，但不抑制AIM2、NLRC4或NLRP1炎癥小體的激活，MCC950減少了體內IL-1β和IL-18的產生，從而用于治療炎癥性疾病和自身免疫性疾病[52]，用MCC950抑制NLRP3炎性體可以改善成骨細胞的遷移并恢復成骨細胞相關蛋白的表達[51]；通過靶向NLRP3的shRNA抑制NLRP3炎性體也可以增加成骨標志物的表達并增強糖尿病大鼠牙槽骨缺損的愈合[53]；IL-18是NLRP3炎癥小體的另一個重要效應因子，IL-18BP是IL-18的天然拮抗劑，IL-18BP增強成骨細胞分化并抑制NLRP3炎性小體和Caspase-1的激活，并且恢復了骨小梁的微結構[54]。

4.2 NLRP3炎性小體非特異性抑制劑在骨質疏松上的應用 降鈣素基因相關肽(CGRP)以劑量依賴性方式抑制小鼠成骨細胞中NLRP3和IL-1β的表達，促進成骨分化，減少ROS的產生[55]；樹突狀細胞衍生的IFN-λ1通過阻止與NLRP3炎性小體相關的經典NF-κB信號通路并激活JAK/STAT信號通路，抑制LPS誘導的破骨細胞生成和促炎細胞因子的釋放[56]；鳶尾素通過上調Nrf2抑制NLRP3和IL-1β，從而抑制卵巢切除大鼠成骨細胞的凋亡[57]；褪黑激素通過調節Wnt/β-catenin信號傳導抑制NLRP3炎性小體從而抑制雌激素缺乏引起的骨質疏松癥并促進成骨細胞生成[40]；格列本脲顯著降低了糖尿病性骨折模型骨折愈傷組織中IFN-γ、TNF-α和IL-6的表達[58]，并減輕創傷造成的雄性大鼠骨破壞[59]。

合適的NLRP3炎性小體抑制劑去抑制骨丟失是確實有效的研究方向。除了NLRP3炎性小體特異性抑制劑外，仍存在著許多非特異性抑制劑，在研究NLRP3的科研工作中應該進一步推進去研究。

5 NLRP3炎性小體在不同信號通路對骨質疏松的調節作用

(1)RIPK1和RIPK3是兩個同源的絲氨酸/蘇氨酸激酶，抑制RIPK1/RIPK3可以通過抑制NLRP3依賴性NF-κB和MAPKs信號通路來阻礙破骨細胞生成并減輕骨質流失。因此，靶向抑制RIPK1/RIPK3信號可能是開發有效治療破骨細胞相關骨溶解疾病的潛在治療策略[60]。(2)炎癥小體也參與由嘌呤能受體P2X5信號引起的小鼠破骨細胞的超多核[61]。(3)PKR通過調節牙齦卟啉單胞菌感染的成骨細胞中的NF-κB通路誘導NLRP3的表達[36]。(4)高糖通過誘導破骨細胞產生依賴于ROS/MAPKs/NF-κB/NLRP3相關蛋白來增加骨吸收能力，從而導致糖尿病所致的骨質疏松[46]。綜上可見不同信號通路在OP的發生發展上與炎性小體息息相關。

6 總結與展望

本綜述強調了NLRP3在骨質疏松中的研究進展。多種危險因素作用于機體，如細菌感染、雌激素缺乏或衰老信號，許多炎癥通路被激活，通過胞內K+外流、溶酶體裂解、線粒體ROS生成等途徑激活NLRP3炎性小體，誘導IL-18、IL-1β成熟、釋放，引發炎癥級聯瀑布反應，NLRP3炎癥體放大了這一信號，導致骨吸收和骨重建的失衡，進而加速骨質疏松進程。其中主要成分如NLRP3、IL-1β、Caspase-1或GSDMD的N端等等，都有作為藥物靶點的潛力。

關于炎癥小體在骨質疏松中的作用，仍有幾個問題沒有解決。例如：(1)炎性小體在骨功能中的作用是否僅限于IL-1β、IL-18和GSDMD的成熟？(2)抑制炎性小體的途徑是否僅限于組裝、激活或其他反應機制？能否通過阻止K+外排、溶酶體破裂，抑制NEK7和減少ASC寡聚化來抑制NLRP3炎癥小體從而減輕骨質疏松的進程？(3)通過阻斷NLRP3炎性小體并整合多種信號通路如Wnt/β-catenin通路、NF-κB通路和MAPK通路等來降低破骨細胞活性或抑制成骨細胞凋亡的有效策略是什么？(4)針對NLRP3炎性小體的各種抑制劑是否有疊加效應？(5)在沒有感染的情況下，骨微環境中的炎性小體是如何被激活并且介導骨質疏松的？(6)盡管阻斷NLRP3炎癥小體的方法可以通過抑制炎癥來保護骨骼避免骨溶解，正如在各種體內體外模型中所證明的那樣，但這種療法在人類中的療效并不完全一致。這些問題的答案將為以NLRP3炎性小體為中心來治療炎性骨溶解提供理論依據。因此，設計合適的選擇性抑制劑或通過基因調控信號通路網絡來抑制炎性小體是至關重要的，希望更多的研究可以關注炎性小體與骨質疏松的關系，這對于骨質疏松的發病機制和治療策略的制定具有重要意義。