巨噬細胞在器官移植免疫排斥反應中的研究進展

羅登科 綜述 王毅，2 審校

1.海南醫學院第二附屬醫院器官移植科，海南 海口 570100；2.海南醫學院移植醫學研究所，海南 海口 570100

器官移植是目前臨床治療終末期疾病最佳策略之一，是改善器官功能衰竭患者生存質量的希望。隨著移植外科技術的成熟和免疫抑制新藥的研發，受者術后短期發生移植排斥反應的比例逐漸下降，但長期存活率仍然較低。在移植術后第10年，只有約50%的死亡供體捐獻器官和70%的活體供體捐獻器官保持相對穩定的功能[1]。顯然，移植排斥反應是一個極其需要解決的臨床問題，目前所有免疫抑制方案仍然不能完全避免排斥反應發生。

當移植受者的免疫系統將供者的器官組織識別為“異己”時，會攻擊移植物產生排斥反應。獲得性免疫細胞起主導作用，T淋巴細胞則是其中之一。因此，抑制T淋巴細胞活性成為了抗排斥反應相關研究的著手點。鈣調神經磷酸酶抑制劑使T淋巴細胞介導的排斥反應發生率明顯下降。但一些移植受者在接受抗T淋巴細胞治療后并沒有形成免疫耐受，仍然會出現嚴重的排斥反應[2]。因此，T淋巴細胞可能不是唯一引起移植物排斥反應的細胞群。移植免疫排斥反應是固有免疫和適應性免疫系統之間相互作用的結果，固有免疫細胞通過抗原提呈或分泌細胞因子激活T淋巴細胞啟動排斥反應。反之，活化T淋巴細胞會招募大量的固有免疫細胞，包括樹突狀細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等，這些細胞進入移植物后表達相關受體參與排斥反應。有研究發現，移植術后早期巨噬細胞明顯增加，占浸潤白細胞總數的50%[3]。移植物中的巨噬細胞主要為移植物內原有的巨噬細胞和血液中單核細胞遷移分化形成的巨噬細胞。巨噬細胞在免疫系統中發揮雙重作用，既可以作為炎癥效應細胞促進免疫反應的發生，又可作為免疫調節細胞抑制免疫應答。因此，巨噬細胞在器官移植排斥反應的作用不容忽視。現主要總結巨噬細胞分型、抗移植排斥反應作用、免疫耐受以及靶向抑制巨噬細胞等方面的研究進展。

1 巨噬細胞的極化表型與功能

巨噬細胞在微環境中受到某些誘導因素作用后產生特定細胞表型和功能的過程稱為巨噬細胞極化。巨噬細胞有高度可塑性，在識別局部微環境改變后會發生表型的轉換，以保持局部微環境穩態[4]。巨噬細胞傳統上被分為兩型：經典活化巨噬細胞(M1 型巨噬細胞)和選擇性活化巨噬細胞(M2 型巨噬細胞) 。近年來，調節性巨噬細胞(regulatorymacrophages，Mregs)被證實是一類不同于M1和M2型巨噬細胞的亞型。M1型巨噬細胞可由γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等誘導產生，脂多糖/Toll 樣受體4 信號通路是促進巨噬細胞極化為M1 型的重要通路[5]。M1型巨噬細胞具有促炎作用，釋放炎癥相關細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 等，抑制巨噬細胞M1 極化會緩解炎癥反應[6]；產生活性氧物質激活多種促炎途徑，如TAK1、MAPK、NLRP3和NF-κB，引起糖尿病狀態下的血管內皮細胞損傷，有助于糖尿病微血管并發癥的發生[7]；通過分泌外泌體放大輔助性T 細胞反應，加強固有免疫和適應性免疫間的相互作用[8]。此外，M1型巨噬細胞增強抗腫瘤免疫力，抑制腫瘤生長和轉移，是一種新的腫瘤免疫治療方法[9]。M2型巨噬細胞可由白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素13(interleukin-13，IL-13)等誘導產生。M2 型巨噬細胞又可分為四個亞群：M2a 型巨噬細胞、M2b 型巨噬細胞、M2c 型巨噬細胞、M2d 型巨噬細胞[10]。其中M2b 型巨噬細胞在炎癥性疾病中發揮重要作用，特別是在自身免疫性疾病中。研究表明，M2b 型巨噬細胞在系統性紅斑狼瘡的發病中起著直接作用[11]。M2 型巨噬細胞分泌IL-10 等抗炎細胞因子減輕炎癥反應[12]；參與組織損傷后的修復與再生，有研究發現藥物性肝損傷患者肝臟的再生與修復與M2型巨噬細胞數量增加有關[13]；M2型巨噬細胞可促進非小細胞肺癌轉移[14]；具有調節細胞免疫作用，通過上調程序性死亡配體1 的表達，抑制小鼠外周血中CD4+/CD8+T 細胞，并增加骨髓中CD4+CD25+調節性T細胞數量[15]。調節性巨噬細胞(regulatory macrophages，Mregs)是一類相對獨特的巨噬細胞亞型，主要由單核細胞在刺激下誘導分化而來，具有負向免疫調節功能。Mregs 主要由巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、LPS 和IFN-γ誘導生成，能夠分泌IL-10、轉化生長因子β (transforming growth factor β，TGF-β)等抗炎細胞因子調節免疫反應活性。目前Mregs 的特異性標志物尚不清楚，有人認為樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子-3 結合非整合素因子可作為小鼠Mregs 的特異性標志物之一[16]。Mregs 對固有免疫和獲得性免疫均有抑制作用。Mregs可直接抑制T淋巴細胞增殖，也可通過分泌IL-10或誘導調節性T淋巴細胞生成等間接抑制機體免疫反應。研究發現經抗體介導吞噬作用的調節性巨噬細胞通過上調程序性死亡配體1 的表達發揮抑制NK 細胞和T 細胞介導的細胞毒性達到抗腫瘤免疫效應[17]。

2 巨噬細胞在同種異體移植排斥反應中的作用

2.1 巨噬細胞在急性排斥反應中的作用 隨著免疫抑制劑的廣泛應用，急性排斥反應發生率明顯下降，但仍然是移植后常見并發癥，而且急性排斥反應的發生機制仍不完全清楚。急性排斥反應多發生于器官移植術后數小時至一個月內，可分為抗體介導的急性排斥反應(antibody mediated rejection，AMR)和T淋巴細胞介導的急性排斥反應(T cell mediated rejection，TCMR)。巨噬細胞浸潤是同種異體移植急性排斥反應的一個特征。BERGLER 等[18]研究了103 例腎移植受者在AMR和TCMR期間巨噬細胞在移植腎中的浸潤程度，發現移植腎中巨噬細胞的數量顯著增加，而且與移植腎的功能穩定和存活時間有關。因此，巨噬細胞可能是監測排斥反應、移植物功能和預后的潛在標志物。有趣的是，研究發現供體來源的巨噬細胞在心臟移植急性排斥反應中起關鍵作用[19]。當發生急性排斥反應時，移植物中的巨噬細胞多表現為M1 表型，分泌大量的促炎細胞因子破壞血管內皮完整性和誘導細胞毒性T 細胞生成增強適應性免疫應答，造成移植物組織間接損傷[20]。巨噬細胞產生活性氧等氧化物導致同種異體移植組織損傷，從而促進急性排斥反應[21]。在急性排斥反應的移植受者中，移植前M2 型巨噬細胞表面標志物CD163 呈較高表達水平，移植后1 周仍有表達，提示M2 型巨噬細胞可能在腎移植術后早期排斥中發揮作用[22]。然而，KO等[23]觀察小鼠角膜移植物的病理切片發現無急性排斥反應的角膜中存在大量M2型巨噬細胞，提示M2型巨噬細胞對角膜移植物起保護作用。巨噬細胞通過激活適應性免疫觸發移植排斥反應。具有抗原呈遞作用的巨噬細胞通過MHC-抗原肽復合物激活T 淋巴細胞，同時提供共刺激信號以激活T淋巴細胞。此外，巨噬細胞能夠誘導Th17 細胞的分化調節排斥反應。漿細胞識別巨噬細胞遞呈的抗原后分泌特異性抗體導致抗體介導的急性排斥反應的發生。巨噬細胞介導急性排斥反應致使移植物丟失的機制還不完全清楚。有研究團隊在裸鼠皮膚移植AMR模型中發現三磷酸核苷雙磷酸水解酶1可以水解巨噬細胞外二磷酸腺苷為單磷酸腺苷，引起巨噬細胞外二磷酸腺苷減少，抑制其靜息狀態，并促進巨噬細胞活化，從而導致移植物損傷[24]。

2.2 巨噬細胞在慢性排斥反應中的作用 移植后免疫抑制劑的使用降低了急性排斥反應的發生率，然而提高移植物的長期存活率仍然是一個挑戰。急性與慢性排斥反應對于移植物的影響有差別。急性排斥反應主要影響移植物功能的發揮，而慢性排斥反應則是影響移植物的長期存活。慢性排斥反應主要表現為組織纖維化和移植物血管性疾病。組織纖維化是慢性排斥反應導致移植物丟失的重要原因，而促炎型巨噬細胞與移植物組織纖維化有關，但巨噬細胞如何促成纖維化尚不清楚。纖維化引起的慢性移植物損傷是移植術后常見的遠期并發癥,表現為移植物功能進行性減退。研究發現M2型巨噬細胞促使移植腎上皮組織向間質轉化，導致移植腎間質纖維化[25]。移植腎間質纖維化依靠肌成纖維細胞的增殖，巨噬細胞向肌成纖維細胞的轉化過程可能通過Smad3 機制進行調節[26]。移植物血管性疾病是慢性排斥反應的另一種表現，表現為新血管內膜形成和進行性血管狹窄，最終導致移植物缺血壞死[27]。在發生慢性排斥反應的同種異體移植物中，巨噬細胞和CD4+T 細胞在移植物血管周圍聚集。巨噬細胞通過旁分泌信號，激活成纖維細胞和血管平滑肌細胞，這兩者有助于血管纖維內膜增厚。巨噬細胞還參與形成新生淋巴管。SATO 等[28]發現移植肺的慢性呼吸功能損傷與新生淋巴管有關，后者可以促進慢性炎癥反應，加重排斥反應，其原因可能是巨噬細胞分泌的血管內皮生長因子、TNF-α促進淋巴管再生。因此，可以通過調節巨噬細胞功能減少移植物淋巴管再生，從而改善移植物的預后。在發生慢性排斥反應的移植物中，巨噬細胞以M2亞群浸潤為主。有研究表明，術后1年移植物中約92%的巨噬細胞表現為M2 表型，且巨噬細胞總數與纖維化程度呈正相關[29]。雖然慢性排斥反應以M2 型巨噬細胞為主，但活性氧和INF-γ的產生往往提示M1型巨噬細胞的存在。由于巨噬細胞的可塑性，很難分辨出移植物中確切的巨噬細胞表型，可能一部分巨噬細胞正在進行表型的極化，或者在慢性排斥反應的某個時間點，巨噬細胞表現出雙重特征[30]。

3 巨噬細胞在異種移植排斥反應中的作用

異種移植有希望解決移植器官數量短缺問題，而異種免疫排斥反應是需要解決的首要問題。敲除豬體內主要的異種抗原基因可明顯減少豬到靈長類動物異種移植超急性排斥反應的發生，如α-1,3-半乳糖基轉移酶(GalT)、N-羥基神經氨酸(Neu5Gc)、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺轉移酶(β4GalNT2)[31]。巨噬細胞主要參與異種移植急性排斥過程，其激活可能受以下機制影響：(1)抗排斥反應信號通路蛋白跨物種不相容性，如CD47 和CD47信號調節蛋白α；(2)抗原抗體免疫復合物；(3)T 細胞與NK 細胞相互作用；(4)識別危險相關分子模式[32]。

巨噬細胞激活中性粒細胞加劇異種移植物炎癥反應，也可通過吞噬中性粒細胞減輕炎癥。移植物局部的固有免疫反應刺激T 淋巴細胞活化與增殖，后者反過來激活巨噬細胞，從而使巨噬細胞在異種移植免疫排斥反應中發揮直接效應細胞的作用。持續激活的巨噬細胞產生TNF-α、活性氧以及補體破壞異種移植物，但巨噬細胞能夠表達抑制性受體調節免疫排斥反應。

4 巨噬細胞在移植免疫耐受中的作用

近年來，調節性巨噬細胞成為移植免疫耐受的熱點。Mregs 是一類功能上與M1、M2 型巨噬細胞不同且相對獨立的亞群，具有調節免疫應答作用[33]。調節性巨噬細胞是一種免疫抑制細胞，能夠抑制過度的移植免疫反應，從而使宿主對移植物產生免疫耐受。Mregs 可以延長未使用免疫抑制方案的同種異體小鼠心臟移植存活時間，其與Mregs 通過一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)途徑和分泌抗炎因子抑制T淋巴細胞增殖有關[34]。在使用CD40/CD40L阻斷劑的移植免疫耐受研究中發現，C5a補體受體C5aR1促進血液循環中的單核細胞向移植物遷移并向Mregs 分化，成功誘導小鼠心臟移植免疫耐受[35]。CD40L 單克隆抗體可促進Mregs 浸潤移植物，促進調節性T 淋巴細胞的增殖，同時減少CD8+T淋巴細胞的聚集[16]。

M2 型巨噬細胞發揮抗炎作用的同時誘導免疫耐受。在小鼠同種異體胰島移植免疫耐受模型中，經粒細胞集落刺激因子處理后明顯增加了M2型巨噬細胞在移植物中的浸潤程度，后者增強了調節性T細胞免疫耐受的誘導作用[36]。有研究將體外誘導的M2 型巨噬細胞回輸到胰島移植小鼠體內，結果表明M2 型巨噬細胞表現出穩定的抗炎作用和免疫抑制能力，提示體外誘導M2型巨噬細胞可作為誘導移植免疫耐受的一種有效方法[37]。關于M2 型巨噬細胞形成免疫耐受的調控機制尚不明確，需進一步闡明其作用機制。

使用納米顆粒將免疫調節藥物運輸到巨噬細胞中，可誘導巨噬細胞形成免疫耐受。在小鼠皮膚移植模型中，通過納米顆粒輸送霉酚酸類藥物(MPA)，比傳統的MPA療法顯著延長了移植物存活時間，其機制可能是巨噬細胞攝取納米顆粒后會導致程序性死亡配體-1表達上調，降低了巨噬細胞激活T淋巴細胞的能力[38]。

5 調節巨噬細胞抗排斥功能

針對性巨噬細胞治療能減輕巨噬細胞引起的排斥反應，包括減少巨噬細胞浸潤、調節巨噬細胞亞群、抑制巨噬細胞炎癥作用、誘導調節性巨噬細胞生成等。Ras同源基因家族成員A(RhoA)通過調控趨化因子1 表達抑制巨噬細胞向血管內皮遷移，當巨噬細胞缺失RhoA基因后，抑制了巨噬細胞的浸潤，減少移植血管病變和間質纖維化[39]。在一項研究中，間充質干細胞轉染表達的可溶性纖連蛋白樣蛋白2 通過誘導M2 巨噬細胞極化調節免疫耐受，從而抑制小鼠心臟移植急性排斥反應[40]。M2c 型巨噬細胞是以分泌IL-10和TGF-β1為特征的巨噬細胞亞群。將大鼠骨髓來源的M2c型巨噬細胞注入肝移植大鼠體內，觀察到移植物中CD8+T 淋巴細胞明顯減少，肝功能得以改善，表明巨噬細胞向M2c 表型的極化改善了大鼠肝移植模型的急性排斥反應，并可能為急性排斥反應提供一種有效的治療方法[41]。

促炎型巨噬細胞分泌促炎因子加重移植物的排斥反應。載有雷帕霉素(mTORi)的高密度脂蛋白(HDL)納米顆粒可抑制巨噬細胞的促炎活性，在心臟移植模型中，mTORi-HDL 減少浸潤移植物的炎性巨噬細胞數量和增加抗炎型巨噬細胞的數量，顯著延長移植物存活時間[42]。納米顆粒技術可能成為器官移植術后靶向巨噬細胞的治療方法。IL-10具有抗炎和免疫調節作用，已被證明通過抑制巨噬細胞來限制炎癥反應。有研究利用豬腎小管上皮細胞轉染人IL-10的基因，發現促炎細胞因子明顯減少，降低人巨噬細胞對豬腎小管上皮細胞的細胞毒作用，緩解了異種移植急性免疫排斥反應，這與IL-10誘導M2型巨噬細胞生成有關[43]。IL-33在移植后早期限制移植物中炎性巨噬細胞，減輕慢性排斥反應。缺少表達IL-33的心臟移植會發生慢性排斥反應，從而加速移植物的丟失[44]。

由于調節性巨噬細胞能夠誘導移植免疫耐受，其在器官移植中顯示出巨大的治療潛力。調節性巨噬細胞可直接抑制T 淋巴細胞的增殖，還可誘導調節性T 細胞分泌IL-10、TGF-β等抗炎細胞因子，間接抑制機體的免疫反應。有研究表明體外產生的人調節性巨噬細胞可作為異種細胞間免疫反應的強效抑制劑，明顯抑制了異種混合淋巴細胞反應中的CD4+和CD8+T 淋巴細胞，而且IFN-γ能增強其抑制能力[45]。通過M-CSF途徑在體內促進Mregs極化也為器官移植受者提供了一種新的治療方法。中性粒細胞分泌的集落刺激因子1 促進Mregs生成和增強移植物中巨噬細胞的免疫抑制功能[46]。調節性巨噬細胞抑制活化T淋巴細胞，并誘導調節性T淋巴細胞的分化，有利于重建移植受者免疫耐受狀態。然而，在調節性巨噬細胞應用到臨床之前，還需要進一步的研究，必須解決調節性巨噬細胞的許多問題，包括Mregs的誘導分化效率、功能穩定性和體內的可塑性等等。

6 小結

器官移植是挽救終末期器官功能衰竭患者生命的可靠手段。雖然實體器官移植在移植物短期存活率方面取得了較好的效果，但長期預后并沒有令人滿意的實質性改變。目前免疫抑制方案主要針對的是適應性免疫系統，而不是固有免疫系統，同時針對適應性免疫和固有免疫系統的治療可能改善移植物長期存活。發生移植免疫排斥反應的機制是多種因素造成的，越來越多的證據表明巨噬細胞是移植物發生急性、慢性排斥反應的關鍵細胞，其通過分泌炎癥介質激活適應性免疫反應，造成移植物功能減退。然而，并不是所有的巨噬細胞都能促進移植排斥反應。不同的巨噬細胞亞群的功能不完全相同，某些巨噬細胞亞群可啟動保護機制調節移植免疫反應。因此，調控巨噬細胞向具有免疫調節功能的表型極化可能為提高移植物長期存活率提供新的治療思路，基于巨噬細胞的靶向治療也許是一種改善移植物預后的方法。