辛烯基琥珀酸淀粉- 可可精油Pickering乳液制備及穩定性研究

王藝潼， 張彥軍， 徐 飛， 王 萍

(1.東北林業大學 林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2.中國熱帶農業科學院 香料飲料研究所/國家重要熱帶作物工程技術研究中心/海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質控制重點實驗室/海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心， 海南 萬寧 571533)

由可可粉制成的飲料作為世界三大飲料之一，在熱帶農業作物生產加工貿易中享有重要地位?？煽蓸?TheobromacacaoL.)屬于梧桐科(Sterculiaceae)可可屬(Theobroma)，可可豆是可可樹的種子且含有豐富的油脂、蛋白質及纖維等成分[1]，也是一種天然的抗氧化劑來源，含有多酚、黃酮類化合物，對心血管健康有益[2]。油脂作為可可豆最主要的成分，產率約為可可豆總量的55%，呈淡黃色[3]，室溫下為乳白色固體，外觀如同白蠟，具有可可特征香氣，物理性質較為獨特[4]，熔點在35.0～36.5 ℃，主要由棕櫚酸、硬脂酸、油酸以及亞油酸等脂肪酸組成[5]。通過各種提取方法從可可豆中提取出的可可精油(cocoa essential oil, CEO)可作為天然抗氧化劑，對心臟具有保健作用，可降低血液中膽固醇、降低血糖血脂，對于人體炎性反應有抑制效果[6-7]。

Pickering乳液是一種由固體顆粒穩定的乳液，區別于傳統乳液，具有穩定性高、抗Ostwald成熟、安全性好等優點，廣泛應用于食品、藥品和化妝品領域[8]。精油由于自身的不穩定性及易揮發性，阻礙了精油功能的利用。Pickering乳液的制備作為一種新型包埋技術，較多的應用于包埋精油，使其形成穩定乳化體系。其中辛烯基琥珀酸(octenyl succinic acid, OSA)淀粉作為一種最常見的改性淀粉顆粒被較多應用于乳液制備，淀粉進行酯化改性后具有疏水性，可以吸附在油水界面，提高乳液穩定性。Song等[9]通過研究OSA改性大米淀粉顆粒穩定的Pickering乳液發現，當淀粉質量分數為4.0%、油相體積分數為50%時可以達到長期乳液穩定。Marefati等[10]通過比較藜麥淀粉以及OSA改性后藜麥淀粉穩定的Pickering乳液發現，增加OSA取代度有助于增強乳液穩定性，減小粒徑分布。Marefati等[11]通過OSA改性藜麥淀粉顆粒穩定Pickering乳液，發現其8年內具有顯著的穩定性且沒有聚結跡象。

已有文章對淀粉改性穩定性的研究較多，而針對OSA改性淀粉穩定的可可精油Pickering乳液穩定性的研究較少。因此，本研究選取可可精油(CEO)作為油相，利用GC- MS測定其內部脂肪酸成分，并以OSA淀粉作為固體顆粒穩定可可精油制備的Pickering乳液，通過改變淀粉質量濃度以及精油體積分數，探究乳液粒徑變化趨勢。通過微觀結構觀察、傅里葉紅外光譜結構分析對乳液形成狀態以及界面形成方式進行研究，探究不同環境條件對乳液穩定性的影響，以期為后續精油及其乳液高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可，中國熱帶農業科學院香料飲料研究所(2020年3月)；辛烯基琥珀酸淀粉，源葉生物科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍，上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HA640- 70- 27- C(2)型超臨界CO2萃取裝置，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；FJ200- SH型數顯高速分散均質機，上海標本模型廠；JY92- 2D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；AL104型電子天平，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司；Cascada III.I 10型超純水系統，美國PALL公司；BX51型正立熒光顯微鏡、FV10i型激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Prox型臺式顯微能譜一體機，荷蘭Phenom公司；GT SONIC- T20型超聲波清洗機，廣東固特超聲股份有限公司；MB45型奧豪斯快速水分測定儀，奧豪斯儀器上海有限公司；7890A- 5975C型氣相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫有限公司；MasterSizer 3000型粒徑分析儀，英國Malvern公司。

1.3 實驗方法

1.3.1可可精油提取

采用超臨界CO2萃取法提取可可精油。將干燥可可豆粉碎、過篩，得到可可粉，放置烘箱內將水分含量降低至6%，保存備用。準確稱取500 g可可粉，放置于萃取釜中，設置萃取加熱溫度35 ℃，分離加熱溫度36 ℃，CO2流速68.5 km/h，萃取釜、分離釜Ⅰ、分離釜Ⅱ壓力分別為29、10、4 MPa，多次提取得到可可精油。

1.3.2可可精油脂肪酸組成分析

1.3.2.1 脂肪酸甲酯化

取1 mL可可精油于250 mL磨口錐形瓶中，加入質量分數2%的氫氧化鈉- 甲醇溶液，80 ℃水浴冷卻回流1 h，直至油滴消失。加入7 mL質量分數15%的三氟化硼- 甲醇溶液，繼續回流2 min，清洗回流管，取下燒瓶冷卻至室溫。加20 mL正庚烷，振搖2 min，再加飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層5 mL正庚烷提取物至25 mL具塞試管中，加入約4 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層液體測定脂肪酸組成。

1.3.2.2 脂肪酸含量的GC- MS分析

可可精油脂肪酸分析按照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》[12]進行分析。色譜條件：色譜柱DM- 2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)。進樣器進樣溫度240 ℃，檢測溫度280 ℃，升溫程序為初始溫度100 ℃，保持13 min；10 ℃/min升溫至180 ℃，保持6 min；繼續以1 ℃/min升溫至200 ℃，保持20 min；最后以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持10.5 min。載氣為Ne，不分流進樣，開閥時間60 s。

電子轟擊(EI)離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS 四極桿溫度150 ℃，質量掃描范圍40～450，溶劑延遲4 min，檢測模式為全掃描模式。所得圖譜經計算機譜庫(NIST 14)檢索，用色譜峰面積歸一化法測定各脂肪酸的相對含量。

1.3.3可可精油Pickering乳液制備

準確稱取一定質量OSA淀粉，按照一定比例加入去離子水，在85 ℃下充分攪拌0.5 h后，冷卻降溫至50 ℃，制備的淀粉質量濃度分別為50、100、150、200、250、300 mg/mL。按照一定比例量取可可精油，逐滴加入到一定質量濃度的OSA淀粉溶液中，使最終總體積為10 mL，油相體積分數梯度設置為5%、10%、15%、20%、25%、30%。在相同溫度條件下，剪切攪拌3 min，轉速為10 000 r/min制備初乳液。在超聲功率375 W條件下將初乳液超聲4 min，得到可可精油Pickering乳液。

1.3.4可可精油Pickering乳液表征

1.3.4.1 粒徑測定

取適量可可精油Pickering乳液，用蒸餾水稀釋100倍后，室溫(25±1) ℃下以馬爾文激光粒度儀測定其平均粒徑。折射率分別為1.46和1.33，每個樣品測定9次，每次間隔10 s。

1.3.4.2 微觀結構觀察

1)光學顯微鏡觀察。取10 μL乳液滴至載玻片，蓋上蓋玻片，使用正立熒光顯微鏡放大100 倍進行觀察，以評估液滴大小以及聚集狀態。

2)激光共聚焦顯微鏡觀察。將2 mL乳液樣品加入離心管中，用50 μL 質量分數為0.1%的尼羅紅和50 μL質量分數為0.1%尼羅藍染色，混合均勻5 min，避光保存2 h后測定。尼羅紅與尼羅藍分別選取488 nm與633 nm波長下測定，由氦氖(He- Ne)激光激發[13]。

3)掃描電鏡觀察。先將Pickering乳液進行噴霧干燥制備成粉末后，再通過掃描電鏡觀察表面形態。噴霧干燥條件：進口溫度為140 ℃，出口溫度為85 ℃，抽氣速率為100%，蠕動泵溫度為40 ℃，進料流速為600 L/h，自動噴嘴清洗6次。將干燥后的粉末固定在具有雙面膠的金屬棒上，經過噴金后，在掃描電鏡上以10 kV的加速電壓觀察。

1.3.4.3 紅外光譜分析

將可可精油Pickering 乳液、OSA淀粉以及CEO，分別進行傅里葉紅外光譜分析，在室溫條件下采用壓片法測定。取干燥后的KBr粉末，研磨后放置壓片機中制備成一定直徑及厚度的透明片，分別將相同體積的精油、淀粉乳以及Pickering乳液涂抹至光滑表面，放至儀器光束中測定。使用400～4 000 cm-1的區域進行掃描，分辨率為4 cm-1，總共掃描64次。

1.3.4.4 Pickering乳液穩定性測定

1)pH穩定性。將乳液置于50 mL離心管中，利用HCl或NaOH將乳液pH值調至2～8，并用錫紙包裹試管放置暗處6 h，將乳液稀釋50倍后分別測定其zeta電位及粒徑變化趨勢[14]。

2) 鹽離子穩定性。將適量的NaCl粉末直接加入到新制備的乳液中，濃度為0.1～0.5 mol/L，用錫紙包裹試管并將其放置暗處6 h。觀察是否分層，測定乳液粒徑變化趨勢[15]。

3) 貯藏穩定性。不同淀粉質量濃度以及不同精油體積分數制備的Pickering乳液在室溫(25±1) ℃，避光條件下靜置21 d，分別在1、3、5、7、14、21 d取樣，測定粒徑變化趨勢。

1.4 數據處理

所有實驗均進行3次重復，數據最后以平均值±標準差表示。采用SPSS 21.0.1中的單因素分析方法對實驗中數據進行顯著性分析，P<0.05 為顯著相關，采用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 可可精油主要脂肪酸成分分析

可可精油中主要脂肪酸組成見圖1和表1。由圖1和表1可知，可可精油中主要分離鑒定出6種脂肪酸，主要成分為飽和脂肪酸，占總脂肪酸質量分數的64.675%，不飽和脂肪酸質量分數為35.325%。6種脂肪酸中硬脂酸含量最高，占總脂肪酸的37.914%。十七烷酸、花生酸含量均低于1.000%。Jia等[16]研究表明：可可精油是由棕櫚酸(21.7%～27.0%)、硬脂酸(30.6%～39.2%)和油酸(29.4%～35.4%)等脂肪酸構成，亞油酸為2.2%～3.4%，花生酸約占2.0%。本研究所用可可精油的簡單脂肪酸均與Jia等[16]的測定結果類似，而亞油酸與花生酸含量差異歸因于原料、產地等的不同。

圖1 可可精油脂肪酸總離子流色譜

表1 可可精油的主要脂肪酸

2.2 可可精油Pickering乳液制備工藝優化及結構表征

2.2.1淀粉質量濃度對乳液粒徑的影響

不同淀粉顆粒質量濃度制備的乳液中，當顆粒質量濃度增加時，乳液液滴尺寸減小，直至達到一個基本恒定值，表明到達全覆蓋條件[17]。不同淀粉質量濃度與乳液粒徑大小及分布的關系見圖2。圖2(a)為不同OSA淀粉顆粒質量濃度制備的可可精油Pickering乳液的D4,3變化趨勢。

圖2 淀粉質量濃度與乳液粒徑大小及分布的關系

由圖2(b)可知，當油相體積分數為5%時，隨著OSA淀粉顆粒質量濃度增加，乳液粒徑逐漸減小且分布越來越集中、均勻。當顆粒質量濃度為50 mg/mL時，粒徑分布出現雙峰，分布范圍為0.576～2.820 μm，這與Li等[18]實驗結果一致。本研究產生雙峰的原因在于乳液中同時存在著均勻且顆粒較小的液滴以及通過聚集產生的大液滴。當顆粒質量濃度為100 mg/mL時，粒徑分布雙峰消失、范圍增大，分布范圍向左偏移，粒徑尺寸范圍為0.577～2.540 μm。而后，隨著淀粉顆粒質量濃度繼續增加，粒徑尺寸降低，此時空間位阻變大，液滴聚集率降低。顆粒質量濃度大于200 mg/mL時，再次出現雙峰，此時較小的峰是由多余的游離淀粉產生。當顆粒質量濃度為250 mg/mL時，粒徑尺寸達到最低，D4,3為(0.796±0.004) μm。根據陸蘭芳等[19]實驗結果，本研究產生此現象的原因可能是此時淀粉顆粒穩定界面層較為穩定，更多顆粒在油滴表面附著，形成更致密的網絡結構。當淀粉顆粒質量濃度達300 mg/mL后，乳液體積密度逐漸增大，淀粉顆粒在液滴表面覆蓋厚度增加，反而增加了乳液粒徑。

表2為不同淀粉質量濃度制備的乳液液滴尺寸分布，同樣表明，隨著淀粉顆粒質量濃度的增加，液滴尺寸(D50、D60和D90)逐漸減小。當淀粉顆粒質量濃度高于200 mg/mL時，液滴尺寸保持普遍穩定；且質量濃度250 mg/mL時，粒度最小。

表2 不同淀粉質量濃度制備的乳液液滴尺寸分布

2.2.2精油體積分數對乳液粒徑的影響

圖3為不同精油體積分數與乳液粒徑及分布的關系。由圖3(a)可知，隨著精油體積分數增加，乳液粒徑逐漸增大，當精油體積分數到達一定程度時，OSA淀粉顆粒不足以完全覆蓋液滴表面，使乳液穩定性變差，從而產生油相外析的破乳現象。

圖3 精油體積分數與乳液粒徑大小及分布的關系

由圖3(b)可知，隨著可可精油體積分數的增加，單位體積內乳液的含油量增加，液滴粒徑尺寸增大，表面覆蓋OSA淀粉層變薄，無法形成致密的穩定吸附層，液滴之間的相互作用促進了聚集。當精油體積分數為10%時，OSA淀粉可以完全覆蓋油滴表面，形成穩定的界面結構。固定淀粉質量濃度250 mg/mL，精油體積分數10%時，乳液粒徑增長幅度比5%時小，說明在此精油體積分數下，單位體積的液滴中可以包裹更多精油且粒徑尺寸保持相對穩定。當精油體積分數上升至15%以上時，粒徑分布出現明顯雙峰；并隨著精油體積分數的升高，后峰峰值逐漸增大，說明質量濃度為250 mg/mL的淀粉顆粒在形成相對較小液滴的同時，剩余顆粒為將精油完全包裹，從而形成了較大液滴顆粒，同時淀粉顆?？赡軆A向于聚集后產生較大尺寸的團聚塊。當精油體積分數為30%時，后峰體積分布大于前峰，粒徑分布范圍為0.675～5.820 μm。

表3為不同精油體積分數制備Pickering乳液液滴尺寸分布。結果表明：精油體積分數為5%與10%時，乳液的D50和D60變化較小，但D90具有較大差異，說明淀粉質量濃度250 mg/mL時可以形成大量小液滴且液滴粒徑分布均勻。本研究中淀粉顆粒質量濃度高于150 mg/mL時，乳液液滴粒徑成階梯狀逐漸升高，推斷這可能與逐漸增加的精油體積分數有關[20]。精油添加量越高，乳液之間混合效率越低，從而導致更寬的粒徑分布，以至于產生雙峰分布狀態，而在精油體積分數30%時粒徑達到最大值。

表3 不同精油體積分數制備的乳液液滴尺寸分布

2.2.3紅外光譜分析結果

OSA淀粉、CEO以及Pickering乳液的紅外光譜如圖4。

圖4 OSA淀粉、CEO、乳液結構光譜

2.2.4微觀結構分析

圖5為Pickering乳液光學顯微鏡下的粒徑分布。由圖5可知，在100倍顯微鏡下觀察到乳液呈小液滴狀態，液滴大小均一且分布均勻。同時從粒徑分布趨勢也可以看出，乳液粒徑基本呈正態分布，右側小峰值產生歸因于小液滴聚集，分布范圍較小，粒徑大小主要集中在0.464～1.150 μm，平均粒徑D4,3為(0.783±0.021) μm。

圖5 Pickering乳液光學顯微鏡下粒徑分布

圖6為Pickering乳液激光共聚焦圖。圖6(a)為乳液液滴顆粒熒光局部圖，其中油相信號設置為紅色，淀粉信號設置為綠色。由圖6(a)可以清晰看出油滴被淀粉緊密包裹，說明形成了穩定的顆粒包合結構，同時印證紅外光譜分析結果，兩相可能由于靜電相互吸引作用來穩定液滴表面。乳液液滴較小，可以觀察到2個液滴相互聚集現象，其間由淀粉連接，這說明粒子之間可以由表面淀粉相互作用連接產生聚集。本研究中可能是在單獨均勻分布的液滴顆粒表面形成單層結構，淀粉溶液充滿精油表面以及油滴之間，形成相互連接橋梁，使乳液穩定[26]。圖6(b)為乳液液滴放大后熒光顯微鏡圖，放大后可以更明顯地看出油滴外部由一圈淀粉環包裹，液滴整體圓滑均勻，證明此時可可精油Pickering乳液體系穩定且均一。

圖6 Pickering乳液激光共聚焦圖

OSA淀粉及乳液掃描電鏡圖見圖7。由圖7(a)可知，淀粉顆粒大小不均一且存在球形和不規則形狀。圖7(b)為經噴霧干燥后的乳液顆粒，此時顆粒密度較大，連接較為緊密，單位面積內的固體顆粒大小較為均勻，但形態不規則，表面有較多褶皺。此研究結果產生的原因可能是噴霧干燥法對顆粒形態產生了較大影響，液滴在噴干過程中發生聚集，加熱過程水分快速蒸發，造成顆粒表面出現收縮現象[27]。結合粒徑測量結果發現：掃描電鏡觀察到經過噴霧干燥后的乳液液滴粒徑增大，原因可能與噴霧干燥后顆粒聚集相關。理想狀態下噴霧干燥的顆粒表面為光滑圓球，根據Zhou等[28]研究結果，本研究由于顆粒乳化能力、OSA淀粉性質以及工藝參數的差異導致顆粒形態各異。由噴霧干燥制備的顆粒只有少數表面較為光滑平整，大部分表面出現凹陷、褶皺，但無明顯裂痕，如圖7(c)，說明CEO被很好地包裹至淀粉中。這與柳艷梅[29]制備OSA- 殼聚糖雙層乳液實驗結果相似。

圖7 OSA淀粉及Pickering乳液掃描電鏡

2.3 可可精油Pickering乳液穩定性分析

2.3.1pH值對乳液穩定性的影響

圖8為pH值對乳液粒徑及zeta電位的影響。隨著pH值的增加，粒徑呈逐漸增大的趨勢，電位絕對值呈現先增大后減小的趨勢。在低pH值(2～5)時，乳液液滴粒徑尺寸保持相對較??；相比于新鮮制備的Pickering乳液(pH值為5)，pH值降低時粒徑尺寸變小，電位絕對值增大，顆粒之間電荷相互作用較強，顆粒不易聚集。隨著pH值的升高(6～8)，粒徑尺寸突增后保持穩定，電位絕對值逐漸減小。根據張琳琳等[30]實驗結果分析本研究產生此現象的原因可能是體系的pH值改變，導致了液滴表面電荷以及界面結構的變化，從而影響了顆粒之間的靜電相互作用，降低了顆粒之間的緊密聯結程度，最后影響乳液穩定性，表現為乳液粒徑的增大和電位絕對值降低。pH值 5左右時為酸性環境，帶有負電荷的淀粉顆粒之間靜電力顯著增加，此時液滴之間不易聚集，雖然粒徑略有增加，但變化不明顯，此時電位絕對值處于最大值，可以形成較為穩定的乳液體系。pH值在6及以上時，OSA淀粉穩定的乳液體系變得不穩定，粒徑顯著增加且電位絕對值降低。液滴相互聚集、粒徑增大的原因可能是界面帶電量降低，淀粉顆粒之間沒有足夠的靜電力穩定乳液[31]。研究表明，pH值5時，乳液處于相對穩定狀態。

圖8 pH值對Pickering乳液粒徑以及zeta電位的影響

2.3.2鹽離子濃度對乳液穩定性的影響

鹽離子濃度對Pickering乳液粒徑的影響見圖9。由圖9可以看出，隨著鹽離子濃度增加，乳液粒徑呈現逐漸增大的趨勢。乳液在低離子濃度(0～0.3 mol/L)下，內部靜電斥力較為穩定，粒子彼此間的相互作用力有效地防止了聚集，提高了液滴顆粒大小的均一性，防止乳液穩定性變差。高離子濃度(0.3～0.5 mol/L)作用下，排斥作用強度小于粒子間相互吸引力，這可能是造成乳液液滴聚集和粒徑增長的原因[15]。通過粒徑測量發現，高離子濃度下的乳液內部不穩定，多次測定結果產生較大誤差，這是由于加入過量鹽離子后，產生靜電屏蔽效應，液滴之間的靜電斥力以及空間位阻都會減少，乳液穩定性降低，內部均一性變差，這與Li等[32]實驗結果相同。

圖9 鹽離子濃度對Pickering乳液粒徑的影響

2.3.3貯藏時間對乳液穩定性的影響

圖10(a)為不同淀粉質量濃度下制備的可可精油Pickering乳液貯藏過程中粒徑的變化。隨著貯藏時間的增加，乳液粒徑依舊保持隨淀粉質量濃度增加，粒徑減小的趨勢。其中，3 d時的50 mg/mL淀粉顆粒穩定的乳液粒徑急劇增大，現象產生的原因可能是小液滴出現聚集狀態，相互融合形成大液滴[33]，說明體系內部不穩定；還可能是由于Ostwald成熟過程，即較小的液滴逐漸聚集增大為較大液滴，直至小液滴消失的過程，此時粒徑由1.500 μm增長至1.890 μm。而3 d后各淀粉質量濃度制備的乳液粒徑保持平穩增長。至14 d時，50～200 mg/mL淀粉質量濃度下的乳液粒徑增長約0.500 μm，21 d時粒徑最大達2.760 μm;相反淀粉質量濃度250 mg/mL以上的乳液保持相對穩定狀態且乳液均勻未出現分層現象。

圖10 不同貯藏時間對乳液粒徑的影響

圖10(b)為不同CEO體積分數制備的Pickering乳液貯藏過程中粒徑的變化。隨著貯藏時間的增加，乳液粒徑呈現逐漸增大趨勢且在CEO體積分數為30%時，具有最大粒徑，3.760 μm，同時乳液出現分層。當精油體積分數5%時，乳液在前7 d均保持穩定且粒徑變化不明顯，這是由于質量濃度為250 mg/mL的淀粉顆?？梢酝耆∮偷?，顆粒之間緊密銜接，將精油分散包裹成小液滴。而7 d后的乳液粒徑突然增大，這是由于淀粉顆粒與顆粒之間的相互碰撞增加了液滴聚集的可能，淀粉分子之間的相互作用也可以吸引液滴相互聚集，造成乳液粒徑增大[34]，這也是不同精油體積分數制備的Pickering乳液粒徑隨貯藏時間延長而增大的主要原因。

3 結 論

利用OSA淀粉作為固體顆粒穩定劑，穩定以CEO為油相的Pickering乳液。形成的乳液液滴呈球形，淀粉質量濃度為250 mg/mL且精油體積分數為10%時，粒徑為0.780 μm左右。通過光學顯微鏡、掃描電鏡以及激光共聚焦熒光顯微鏡證明乳液油水界面表面光滑，傅里葉紅外光譜分析結果表明形成的乳液內部并沒有新的化學鍵生成，說明淀粉與精油之間可能存在其他相互作用。向乳液中添加離子濃度大于0.3 mol/L的NaCl時，粒徑尺寸呈急速上升趨勢，此時乳液極不穩定；pH值在5左右時，乳液相對穩定；通過21 d貯藏穩定性分析不同淀粉質量濃度和精油體積分數制備的乳液的粒徑變化，表明乳液粒徑隨時間增加均變大，但相同貯藏時間下，隨著淀粉質量濃度增加，乳液粒徑減小，而精油體積分數增加導致乳液粒徑增大。