不同溫度與發酵方式制作的哈密瓜幼果泡菜品質比較

黃 巖，鮮 雙，杜 娟，劉興艷，陳安均*

（1.四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014；2.新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究所，新疆 吐魯番 838200）

泡菜是我國傳統發酵蔬菜制品之一，具有改善食欲、促進消化等功效，深受人們喜愛。傳統泡菜多以新鮮蔬菜為原料，適當添加鹽、水和輔料，利用蔬菜表面微生物在厭氧條件下乳酸發酵而制得[1]。水果與蔬菜結構組分接近，也可用于制作泡菜，如泡梨等[2]。哈密瓜是我國極具特色的水果，盛產于新疆吐哈盆地。哈密瓜幼果則是果品生產過程中為防止過度結實，提高果品質量，“疏果”產生的副產物，哈密瓜幼果糖分、有機酸、香氣等成分均與成熟果實差距較大，很大程度上限制其加工利用，造成資源浪費。因此，將哈密瓜幼果用于泡菜制作可較好改善這一問題。

發酵溫度和方式是決定泡菜品質兩大關鍵因素。溫度可通過菌相結構和微生物對營養物質的利用效率影響泡菜品質。汪冬冬等研究溫度對甘藍泡菜發酵過程中風味的影響，發現10～35℃，溫度越高，產酸越快，泡菜成熟越早[3]。He等研究酸菜不同溫度發酵過程中細菌多樣性和揮發性風味物質數量發現，不同溫度下酸菜優勢菌群不同，且揮發性風味物質隨溫度升高而增加[4]。不同發酵方式由于優勢菌群不同也導致泡菜品質差異較大，自然發酵通常周期長且不穩定，而接菌發酵和鹵水發酵可通過增加體系中優勢菌數量，加快泡菜成熟和改善泡菜品質。曹佳璐等研究發現，泡菜發酵過程中優勢菌群主要為明串珠菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬等乳酸菌，且腸膜明串珠菌是泡菜發酵的啟動菌，短乳桿菌和植物乳桿菌是發酵后期優勢菌群[5]。云琳等對比研究接種發酵、鹵水發酵和自然發酵蘿卜泡菜理化特性和風味成分，發現鹵水發酵泡菜中游離酸及氨基酸含量更高，接種發酵泡菜中香氣成分更豐富[6]。

本試驗以哈密瓜幼果為原料，以腸膜明串珠菌、植物乳桿菌、短乳桿菌和戊糖片球菌為接種菌，在12、18和24℃溫度下，以自然發酵泡菜為對照，對比混菌發酵泡菜和鹵水發酵泡菜。通過測定泡菜理化指標、有機酸含量及揮發性風味成分，結合感官評定，分析溫度與發酵方式對泡菜理化指標和感官特征影響，比較不同溫度及發酵方式制得泡菜的特點和差異，旨在為哈密瓜幼果泡菜生產工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮哈密瓜幼果購自新疆維吾爾族自治區鄯善縣；輔料購自雅安市雨城區蒼坪路農貿市場；泡菜鹵水采集自雅安市雨城區老面館自制循環使用的多年老壇。

1.2 菌種

腸膜明串珠菌、短乳桿菌和戊糖片球菌均為四川農業大學食品學院農產品加工與貯藏實驗室保藏菌種，分離自泡菜；植物乳桿菌550購自四川高福記生物科技有限公司。

1.3 試劑

氯化鈉、氫氧化鈉、鉻酸鉀、硝酸銀、亞鐵氰化鉀、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅均為分析純，均購自成都科隆化學品有限公司。

1.4 儀器與設備

雷磁PHS-3CpH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；HC-2062高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；電磁爐，杭州九陽生活電器有限公司；全波段酶標儀（3001-2207），美國Thermo公司；氣相質譜聯用儀（59750），美國Agilent公司；液相色譜儀（Ultimate 3000），美國Agilent公司。

1.5 方法

1.5.1 泡菜發酵工藝

采用自然發酵、混菌發酵和鹵水發酵3種發酵工藝，每種工藝分別在12、18、24℃下密封發酵144 h，每隔24 h采樣測定相應指標，每種處理均作3組平行。

自然發酵工藝：將大小一致、成熟度相近哈密瓜幼果清洗、去皮去籽、切條整形、晾干水氣。各原輔料添加量分別為：800 g哈密瓜幼果，1 600 mL純凈水，80.0 g食鹽，16.0 g鮮辣椒，8.0 g生姜，8.0 g大蒜，6.4 g花椒。

混菌發酵工藝：將腸膜明串珠菌、短乳桿菌、戊糖片球菌及植物乳桿菌550分別在MRS培養基中活化3代，8 000 r.min-1離心后得到菌體，生理鹽水洗滌3遍，將菌懸液濃度調至108CFU.mL-1，以純凈水體積0.2%等比例加入4種菌液，其他輔料添加同自然發酵。

鹵水發酵工藝：每壇添加鹵水300 mL和純凈水1 300 mL，其他輔料添加量同自然發酵。

1.5.2 pH測定

取5 mL泡菜液于10 mL離心管中，pH計測定各樣品pH。

1.5.3 總酸測定

參考國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法測定總酸。具體步驟為：準確稱取5 g泡菜勻漿樣品，精確至0.001 g，置于100 mL燒杯中。用80 mL無CO2水將燒杯中樣品轉移至100 mL容量瓶中，置于沸水浴中煮沸30 min（搖動2～3次，使試樣中有機酸全部溶解于溶液中），取出，冷卻至室溫，再用無CO2水定容至100 mL，經快速濾紙過濾，棄去初始濾液后收集備用。量取濾液15 mL，置于250 mL三角瓶中，加入50 mL無CO2水，3滴1%酚酞指示劑，用0.05 mol.L-1氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至微紅色30 s不褪色。記錄消耗體積數值，計算總酸含量[7]。

1.5.4 鹽度測定

參考趙江欣[8]方法。

1.5.5 亞硝酸鹽測定

參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，采用鹽酸萘乙二胺法。具體步驟為：準確稱取5 g勻漿試樣，精確至0.001 g，置于200 mL容量瓶中，加12.5 mL 50 g.L-1飽和硼砂溶液，加入70℃水約100 mL，混勻，于沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，放置至室溫。加入5 mL 106 g.L-1亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g.L-1乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質。加水定容至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。

吸取40.0 mL上述濾液于50 mL帶塞比色管中，加入2 mL 4 g.L-1對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后加入1 mL 2 g.L-1鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，于波長538 nm處測吸光度，同時作空白對照，最后將所測得吸光度通過標準曲線換算得到式樣中亞硝酸鹽含量[9]。

1.5.6 有機酸測定

參考商景天等方法并略作修改，精確稱取5 g勻漿樣品，精確至0.001 g，用超純水轉移至50 mL容量瓶中，60℃超聲萃取20 min，冷卻至室溫后，用超純水定容至刻度，10 000 r.min-1離心10 min，過0.45μm水系濾膜后上機分析。色譜條件：采用C18色譜柱，流動相為0.01 mol.L-1磷酸二氫鉀和4%甲醇溶液，流速0.6 mL.min-1，柱溫25℃，進樣量10μL，紫外檢測波長為210 nm[10]。泡菜中常見有機酸包括草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸等，選擇上述6種有機酸制作標準曲線，根據標準曲線對泡菜中所測有機酸作定量計算。

1.5.7 揮發性風味物質測定

參考汪冬冬等方法并略作修改[3]。準確稱取5 g（精確至0.001 g）搗碎后泡菜勻漿于15 mL頂空進樣瓶中，加入1.00 g氯化鈉和10μL內標環己酮（26.87 mg.mL-1），置于50.0℃恒溫水浴鍋中平衡10 min后，將手動進樣柄插入進樣瓶中，萃取30 min，將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口，解析5 min，取出萃取頭后分析。

GC-MS操作條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）彈性石英毛細管柱；升溫步驟：36℃保持3 min，以5℃.min-1升至65℃，以3℃.min-1升至108℃，以2℃.min-1升至110℃，以3℃.min-1升至155℃，以20℃.min-1升至200℃，保持3 min。不分離進樣模式；進樣口溫度250℃，載氣為He，流速1.2 mL.min-1，輔助加熱器溫度280℃。質譜條件：電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，質量掃描范圍：50～550 amu。

定性定量分析：由GC-MS得到圖譜，經計算機在NIST.11標準譜庫檢索匹配，篩選出匹配度大于80的揮發性物質，根據內標物環己酮的峰面積和添加量，對篩選出的揮發性物質作半定量分析，得到各組分相對質量濃度。

1.5.8 感官評定

參照陳功方法并略作修改[11]，評分細則見表1。

表1 哈密瓜幼果泡菜感官評價評分細則Table1 Sensory evaluation scorerulesof Hamimelon fruitlet pickles

1.6 數據處理與分析

采用Excel（2016）分析試驗數據均值和標準差，采用IBM SPSSStatistics 27分析顯著性，顯著水平為P＜0.05，使用Origin 2017繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 泡菜發酵過程中p H和總酸變化

圖1a反映不同處理下哈密瓜幼果泡菜發酵過程中pH變化。可發現，除鹵水發酵外，自然發酵和混菌發酵泡菜pH受溫度影響較大，溫度越低，pH下降越緩慢，發酵周期越長，因適宜溫度范圍內，高溫可加快乳酸菌繁殖代謝，加快泡菜發酵過程[12]。通常認為，pH達4.0表示泡菜成熟[13]。鹵水泡菜在發酵24 h內，pH出現明顯下降，并趨于成熟，這是由于鹵水泡菜中存在穩定的微生物群落，微生物可快速利用原料中營養物質生長繁殖。12℃下自然發酵泡菜與混菌發酵泡菜pH下降較為緩慢，此為低溫抑制乳酸菌生長代謝所致。

哈密瓜幼果泡菜發酵過程中總酸變化如圖1b所示，相同溫度下，鹵水發酵泡菜總酸明顯高于其他泡菜，一方面，由于鹵水含有較高含量乳酸等有機酸；另一方面，鹵水中原有數量較多的乳酸菌增強體系乳酸發酵能力。除12℃下自然發酵和混菌發酵泡菜外，其他泡菜在發酵96 h后總酸均出現短暫下降，可能是由于發酵中后期泡菜pH不斷降低，部分微生物為緩解pH持續下降對自身生長造成的影響，分泌氨基酸脫羧酶形成生物胺以提高pH所致[6]。所有鹵水發酵泡菜及24℃下發酵泡菜在發酵144 h后，總酸含量均達到0.4%，由此推測，采用鹵水發酵方式及在一定范圍內高溫發酵泡菜，可明顯加快泡菜成熟速度。

圖1 泡菜發酵過程中p H和總酸含量變化Fig.1 Changes of p H and titratable acidity contents during thefermentation of pickles

2.2 泡菜發酵過程中鹽度和亞硝酸鹽變化

泡菜中鹽度不僅可調節泡菜口感、抑制腐敗菌生長，也可通過滲透壓作用影響微生物代謝，間接影響泡菜風味。圖2a反映哈密瓜幼果泡菜發酵過程中鹽度變化。泡菜發酵前96 h內,鹽度逐步上升，發酵120 h后，部分泡菜鹽度出現下降，最后趨于穩定，最終鹽度為4%～5%，這可能是由于哈密瓜幼果不含鹽分，當浸泡在較高濃度鹽溶液中時，細胞組織滲透壓升高，氯化鈉迅速滲入泡菜中造成鹽分滯留，而后泡菜與泡菜液鹽度逐漸達到動態平衡。12℃鹵水泡菜鹽度最高，為4.79 g.100g-1，因鹵水發酵所添加鹵水中含一定濃度鹽分，導致鹵水發酵泡菜的鹽分略高于其他泡菜，而食鹽滲透進入泡菜速度隨發酵溫度降低而減緩，達到滲透平衡較慢，但此后不同溫度發酵泡菜的鹽度差異小。

哈密瓜幼果泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化如圖2b所示，18℃混菌發酵、24℃自然發酵及混菌發酵泡菜在發酵48 h后，亞硝酸鹽含量達到峰值，這是由于高溫加劇硝酸鹽還原菌代謝活動而導致“亞硝峰”提前出現。鹵水發酵泡菜亞硝酸鹽含量相對較低，且波動范圍小，維持在較低水平，其中24℃鹵水泡菜最終亞硝酸鹽含量最低，為7.16 mg.kg-1，因鹵水泡菜一直維持在較低pH水平，而高酸性條件不利于亞硝酸鹽形成。部分泡菜亞硝酸鹽含量較高，但最終結果均低于20.00 mg.kg-1國家限量標準。

2.3 泡菜感官評定

發酵終點各泡菜感官評定值如表2所示，通過顯著性分析可知，鹵水發酵泡菜在色澤、香氣、滋味和接受度方面均明顯優于自然發酵和混菌發酵泡菜。總體看，混菌發酵泡菜與自然發酵泡菜間無顯著差異，相同發酵方式不同溫度所發酵泡菜之間也不存在明顯差異，而鹵水發酵泡菜與其他兩種泡菜感官評分之間存在顯著差異。可推測，發酵方式是影響泡菜感官品質主要因素，采用鹵水發酵可顯著改善哈密瓜幼果泡菜感官品質。采用鹵水發酵泡菜可提升泡菜品質，提高生產效率，但不同鹵水制得的泡菜難以標準目前尚未實現用于工業化生產。

2.4 泡菜中有機酸變化

采用高效液相色譜法測定9種哈密瓜幼果泡菜發酵終點時有機酸，結果如圖3所示。24℃混菌發酵與鹵水發酵泡菜中6種有機酸均有檢出，其他7種泡菜中未檢出酒石酸。泡菜中有機酸總量隨溫度升高而升高，因溫度升高，促進乳酸菌生長繁殖，使其代謝加快，產酸能力增強。

圖3 不同哈密瓜幼果泡菜中有機酸含量變化Fig.3 Changes of organic acids contents in different Hamimelon fruitlet pickles

乳酸是哈密瓜幼果泡菜中主要有機酸，其含量隨溫度升高而逐漸增加。在12、18℃下，不同方式所發酵泡菜中乳酸含量為：鹵水發酵＞自然發酵＞混菌發酵，可能因混菌發酵所添加的乳酸菌含量較低，在低溫發酵條件下，需較長適應時間和發酵周期，而產酸能力較強的植物乳桿菌、

短乳桿菌和戊糖片球菌主要在發酵中后期發揮作用。由此推斷，鹵水發酵泡菜中乳酸菌生長繁殖更好，代謝更旺盛，可歸因于發酵初期鹵水中存在較為穩定的乳酸菌群。24℃下各泡菜中有機酸總量無顯著差異，但混菌發酵與鹵水發酵泡菜中均檢出酒石酸，可能因混菌發酵和鹵水發酵泡菜中優勢乳酸菌生長更好，發酵過程中產生酒石酸，相關機理有待進一步研究。

酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等味道柔和、刺激性小，可顯著改善泡菜風味，比例協調、多種有機酸共同作用可使泡菜風味更加醇和與豐富[14-15]。這可能是鹵水發酵泡菜獲得高感官評價原因之一。

2.5 泡菜中揮發性風味物質分析

揮發性風味物質是影響泡菜感官品質重要因素，采用頂空固相微萃取技術結合氣相色譜質譜聯用儀測定9種哈密瓜幼果泡菜發酵終點時揮發性香氣成分，如表3所示。共檢出43種物質，包括烴類16種，醇類10種、芳香族化合物6種、酮類4種、酯類3種、醛類2種、醚類和脂肪酸各1種。烴類和醇類是主要香氣成分，9種哈密瓜幼果泡菜共同香氣成分有6種，分別為芳樟醇、2-（5-甲基-5-乙烯基四氫呋喃-2-基）丙-2-基碳酸乙酯、乙酸香葉酯、右旋萜二烯、萜品烯和2,4-二甲基苯乙烯。泡菜風味來源于兩方面，一方面是原材料和輔料中的風味物質，另一方面是經微生物作用后新產生的風味物質。泡菜中芳樟醇含量較高，這是由于在泡菜發酵體系中添加較多花椒，而芳樟醇是花椒主要揮發物，閾值為0.037 mg.kg-1，具有花香、木香等特點，右旋萜二烯閾值為0.20 mg.kg-1，具有柑橘香氣[16]。以上兩種物質是哈密瓜幼果泡菜中含量最高的兩種揮發性成分，且具有較低閾值，含量過高，影響泡菜感官品質。

18℃鹵水發酵泡菜中共檢出22種香氣物質，比12℃（20種）和24℃（18種）下鹵水發酵泡菜中檢出香氣物質多，且18℃鹵水發酵泡菜香氣物質含量相較于12和18℃鹵水發酵泡菜更高，在一定程度上與感官評價結果一致，可推測鹵水發酵泡菜更適于18℃。對于混菌發酵，18℃時發酵泡菜香氣物質同樣較多，但相對含量卻普遍較低，這可能是由于接種菌在18℃條件下形成更豐富的微生物區系，各微生物間通過拮抗作用所致。自然發酵泡菜隨溫度升高香氣種類增加，但含量無顯著差異。

總體上，18℃較12、24℃溫度下發酵泡菜中香氣物質更多，可能是此發酵溫度下保留較多原料本身香味成分同時在微生物發酵作用下也產生較多新的香氣成分所致。

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3 討論與結論

目前，關于哈密瓜副產物研究主要集中在成熟哈密瓜果皮、種子等廢料利用方面，而對于其生長過程中因疏果而得到的哈密瓜幼果開發利用卻少有研究[17]。將哈密瓜幼果用于泡菜生產，不僅豐富哈密瓜產品種類，解決農副產品利用不充分的問題，還促進果農實現增收致富，具有極大經濟價值。

本實驗室前期分析采用自然發酵、鹵水發酵、植物乳桿菌和/或腸膜明串珠菌5種不同發酵方式發酵的哈密瓜幼果泡菜理化特性和氨基酸含量，發現經發酵的哈密瓜幼果泡菜營養均衡性較好，營養價值較高，證明哈密瓜幼果適用于泡菜制作[18]。但該研究并未探究哈密瓜幼果泡菜揮發性風味物質、有機酸等與泡菜品質相關性質，此外，新疆晝夜溫差大，因此探究不同溫度下發酵方式的選擇對哈密瓜幼果在新疆泡菜發酵具有巨大實際意義。

pH和酸度是泡菜發酵過程中重要基礎理化指標，可直觀反映泡菜發酵狀態，同時也反映泡菜中微生物群落結構變化。鹵水泡菜在連續周期發酵過程中可積累大量乳酸菌，發酵體系內環境相對穩定，對干擾因素有較強抵抗能力[19]，因此在發酵過程中pH和亞硝酸鹽含量均相對穩定。但采用自然發酵和混菌發酵方式下，“亞硝峰”較明顯，在發酵24～120 h期間均有不同程度超過國家限量標準，但隨著發酵進行，在發酵終點時亞硝酸鹽含量均低于國家限量標準，其作用機理是亞硝酸鹽與酸作用，產生游離酸，亞硝酸不穩定，進一步分解產生NO[20]。在幾種發酵方式下，發酵96～120 h期間泡菜總酸均有明顯下降趨勢，可能是由于在發酵前期，微生物大量附著在蔬菜表面，使泡菜總酸迅速升高，當哈密瓜幼果營養物質被大量消耗后，微生物代謝速度降低，哈密瓜幼果泡菜與泡菜水之間酸度值逐漸趨于平衡所致[21]。

揮發性風味物質和有機酸作為泡菜發酵過程中重要代謝產物，影響泡菜風味特征，對泡菜風味有突出貢獻，是反映泡菜品質重要指標。乳酸是形成泡菜風味主要有機酸，也是主要發酵產物。在泡菜發酵初期，乳酸菌迅速產酸導致環境pH快速下降，從而抑制不耐酸的雜菌生長繁殖，以保證泡菜產品的安全和品質。發酵溫度與有機酸積累有關，在24℃條件下有機酸積累量最多，盡管不同發酵方式下有機酸總量無顯著差異，但混菌發酵和鹵水發酵條件下，酒石酸積累量明顯高于自然發酵。商景天等研究表明，草酸、酒石酸和乳酸等均降解泡菜中亞硝酸鹽[10]，這對于泡菜安全性具有積極意義。本研究中，9種哈密瓜幼果泡菜共同香氣成分有6種，分別為芳樟醇、2-（5-甲基-5-乙烯基四氫呋喃-2-基）丙-2-基碳酸乙酯、乙酸香葉酯、右旋萜二烯、萜品烯和2,4-二甲基苯乙烯，這6種物質可能是哈密瓜幼果經發酵后的特征性揮發性風味物質，且在18℃鹵水發酵的泡菜中檢測出的揮發性風味物質最多，與感官評分結果一致，且該條件下發酵的泡菜成熟時間短、亞硝酸鹽含量最低（7.16 mg.kg-1）、有機酸含量較高且較為均衡（8.07 g.kg-1）、從營養、感官和安全等方面評價均最佳，因此18℃鹵水發酵泡菜是本研究9種泡菜中品質最優泡菜。

以上結果證實溫度和發酵方式對泡菜品質均有不同程度影響，其最優發酵方式為鹵水發酵，但要用于大批量工業生產還存在一定難度，因鹵水性質難以保持固定，產品品質難以實現標準化，這也是將來研究需要攻克的難題[22]。而混菌發酵在工業生產泡菜上已有較多應用，且表現出較好效果，本研究混菌發酵泡菜較自然發酵泡菜而言，品質改善小，這可能與原料本身及發酵規模有關，限制發酵劑作用效果。關于發酵溫度，總體上泡菜品質隨溫度升高而變好，但溫度過高也加速泡菜腐敗，后續需對泡菜最適發酵溫度及作用機理作進一步研究。