MMP-2和MMP-9基因在牦牛肌肉組織的表達(dá)分析

歐陽(yáng)譚亮，武志娟，信金偉，柴志欣，王吉坤，王海波，張 明，鐘金城*

（1.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，拉薩 850002）

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是一類(lèi)在動(dòng)物組織中廣泛存在、結(jié)構(gòu)相近而功能復(fù)雜的Zn2+、Ca2+依賴(lài)性蛋白水解酶家族，可由骨骼肌干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞等多種肌細(xì)胞分泌[1-2]，主要通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）降解參與調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。根據(jù)MMPs降解底物及結(jié)構(gòu)特征可將其分為6種類(lèi)型：明膠酶、膠原酶、間質(zhì)溶解素、基質(zhì)溶解因子、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶及其他類(lèi)型基質(zhì)金屬蛋白酶。明膠類(lèi)酶MMPs包含MMP-2和MMP-9兩種，在機(jī)體中主要受基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（Matrix metalloproteinase inhibitor，TIMP）調(diào)控，與TIMPs互作可調(diào)控肌肉組織相關(guān)功能。

研究顯示，畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育程度與其肉品質(zhì)高度相關(guān)，明膠類(lèi)酶MMPs可通過(guò)降解底物調(diào)控肌肉ECM中膠原蛋白含量，參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及修復(fù)等生物過(guò)程[3-4]，影響肌肉品質(zhì)。Michenlin等發(fā)現(xiàn)，富含大理石紋的牛肌肉組織ECM中含有大量膠原蛋白，且肌纖維含量高的牛肉中MMP-2酶活性也更高[5]。祁艷霞等通過(guò)分析不同年齡南陽(yáng)牛背最長(zhǎng)肌中MMP-2、MMP-3和MMP-13基因表達(dá)水平與肉質(zhì)指標(biāo)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MMP-2與肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）沉積相關(guān)，且在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)顯著下降[6]。Park等發(fā)現(xiàn)在閹牛和公的背最長(zhǎng)肌中，MMP-9表達(dá)量與肌纖維含量呈正相關(guān)[7]。

牦牛具有抗逆、耐粗飼、抗病能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，是青藏高原不可或缺的重要畜種[8]。牦牛肉具有高蛋白、低脂肪，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等特點(diǎn)，是優(yōu)質(zhì)天然的綠色食品。牦牛骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)其肉質(zhì)有重要影響。研究表明，MMP-2與MMP-9對(duì)普通牛肉質(zhì)均有影響，但有關(guān)牦牛MMP-2、MMP-9基因相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，相關(guān)研究顯示明膠類(lèi)酶MMPs在動(dòng)物心肌組織中表達(dá)，可防止動(dòng)物心肌肥大[9-10]，且MMP對(duì)牦牛低氧適應(yīng)性也具有影響[11]。本研究通過(guò)對(duì)牦牛MMP-2和MMP-9基因測(cè)序及生物信息學(xué)分析、組織差異表達(dá)研究，探索其對(duì)牦牛肉質(zhì)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以期為牦牛良種選育和改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

于四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣選取0.5、1.5和2.5歲健康麥洼牦牛各3頭，分別采集心臟和臀大肌組織，使用DEPC水沖洗干凈，錫箔紙包裹，將其迅速置于液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

試驗(yàn)主要試劑：TaqDNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自博邁德生物公司；RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TBGreen Premix ExTaqⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；鼠抗MMP-2、MMP-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司。

1.2 基因克隆與測(cè)序

利用Trizol法提取組織總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA片段，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照GenBank中黃牛MMP-2 mRNA序列（NM_174745.2）和MMP-9 mRNA序列（NM_174744.2），選取GAPDH（XM_014482068）為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5軟件和NCBIPrimer-BLAST在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增MMP-2和MMP-9基因CDS區(qū)，根據(jù)克隆所得序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（見(jiàn)表1），引物由北京擎科梓熙（成都）生物技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系（15μL）：上下游引物各0.6μL、cDNA模板0.6μL、ddH2O 5.7μL、2×TaqPCR MasterMix 7.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火溫度見(jiàn)表1，72℃延伸90 s，循環(huán)35次，72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。測(cè)序所得序列利用DNAMAN軟件拼接組裝，獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因序列，NCBI-BLAST在線(xiàn)比對(duì)工具核對(duì)CDS區(qū)。

表1 牦牛MMP-2和MMP-9基因克隆引物序列信息Table 1 Primer sequence of yak MMP-2 and MMP-9 genes for cloning

續(xù)表

1.3 組織差異表達(dá)分析

分析MMP-2、MMP-9及其相關(guān)基因和底物基因MMP-14、TIMP-2、CL1A1（Ⅰ型膠原蛋白）和CL3A1（Ⅲ型膠原蛋白）在0.5、1.5和2.5歲牦牛心肌和臀大肌組織中表達(dá)量。反應(yīng)體系（10μL）：TB Green Premix ExTaqⅡ5μL、上下游引物各0.4μL、ddH2O 3.2μL、模板cDNA 1μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 免疫組織化學(xué)分析

將不同年齡牦牛臀大肌從4%多聚甲醛固定液中取出，制成石蠟切片，使用5%胎牛血清封閉，分別以鼠抗MMP-2、MMP-9單克隆抗體（1∶100）為一抗，4℃孵育過(guò)夜；以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的多聚山羊抗鼠IgG（1∶200）為二抗。經(jīng)免疫組化觀察MMP-2和MMP-9蛋白在不同年齡牦牛臀肌中表達(dá)情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)基因分別設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS22.0軟件作單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。利用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定肌纖維著色面積及免疫組化相對(duì)平均光密度值，并用GraphPad Prism5繪制MMP-2、MMP-9在臀大肌和心臟組織中mRNA轉(zhuǎn)錄水平和組化結(jié)果分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛MMP-2和MMP-9基因CDS區(qū)大小

分別獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因片段長(zhǎng)度一致的清晰條帶（見(jiàn)圖1），通過(guò)拼接可知MMP-2基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為1 983 bp，開(kāi)放閱讀框1 209 bp，共編碼402個(gè)氨基酸；MMP-9基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為2 137 bp，開(kāi)放閱讀框1 329 bp，編碼442個(gè)氨基酸，序列信息已提交NCBI，MMP-2和MMP-9登錄號(hào)分別為MZ476247和MZ476248。

圖1 牦牛MMP-2和MMP-9基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCRamplification resultsof MMP-2 and MMP-9 genesin yak

2.2 牦牛MMP-2和MMP-9基因似性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

利用MegAlign 7.0軟件分別將牦牛MMP-2和MMP-9基因序列與穴兔、斑馬魚(yú)、小家鼠、黃牛、家雞、獼猴、灰倉(cāng)鼠、野豬、家犬、綿羊、馬、北美虹鱒魚(yú)、虎斑頸槽蛇和烏鴉相應(yīng)基因序列作比對(duì)（見(jiàn)表2）。

由表2可知，牦牛與黃牛序列相似性最高，與斑馬魚(yú)序列相似性最低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，牦牛與黃牛親緣關(guān)系最近，其次是綿羊，而與斑馬魚(yú)、北美虹鱒魚(yú)、烏鴉和虎斑頸槽蛇等動(dòng)物親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 牦牛MMP-2（左）和MMP-9（右）基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of MMP-2(left)and MMP-9(right)

表2 牦牛MMP-2和MMP-9基因與其他物種序列相似性比對(duì)Table 2 Comparison of MMP-2 and MMP-9 sequence similarity between yak and other species

2.3 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

使用ExPASy中Prot Param和ProtScale程序預(yù)測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白理化性質(zhì)。結(jié)果表明，MMP-2和MMP-9蛋白均為親水性酸性蛋白，二者甘氨酸（Gly）含量最高，其次為天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）；不穩(wěn)定系數(shù)分別為34.72和42.82，故MMP-2屬于穩(wěn)定蛋白，MMP-9屬于不穩(wěn)定蛋白。通過(guò)在線(xiàn)軟件ExPASy-TMpred、SignalP 5.0預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MMP-2與MMP-9蛋白均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，且MMP-2無(wú)信號(hào)肽。利用NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白序列磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示MMP-2基因編碼氨基酸中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)；MMP-9基因編碼氨基酸包含6個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、7個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。利用NetNGlyc 1.0預(yù)測(cè)其O、N糖基化位點(diǎn)，結(jié)果表明，MMP-2蛋白包含5個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（Thr279、Thr286、Thr289、Thr291、Thr386），MMP-9蛋白存在4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)（Thr27、Thr37、Thr90、Thr273）。此外，MMP-2蛋白未檢測(cè)到N-糖基化位點(diǎn)，MMP-9則檢測(cè)到3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（Asn38、Asn120和Asn127）。

2.4 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用在線(xiàn)軟件PSORT II Prediction分析牦牛MMP-2和MMP-9蛋白細(xì)胞亞定位，發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)（65.2%）和細(xì)胞核（17.4%），在細(xì)胞骨架、液泡、高爾基體和囊泡中分布比例均為8.7%；MMP-9蛋白主要定位于細(xì)胞外基質(zhì)（66.7%），其次為液泡（22.2%）和質(zhì)膜（11.1%）。利用NCBI-CD Search預(yù)測(cè)牦牛MMP-2和MMP-9蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，牦牛MMP-2和MMP-9蛋白均含有纖連蛋白2型結(jié)構(gòu)域（Fibronectin type 2 domain，F(xiàn)N2）和基質(zhì)蛋白（Matrixin）。此外，MMP-9還有3個(gè)α螺旋組成的肽聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于細(xì)菌細(xì)胞壁降解所涉及各種酶N或C末端，具有肽聚糖結(jié)合功能。

圖3 MMP-2和MMP-9保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of MMP-2 and MMP-9 conserved domain

2.5 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能

牦牛MMP-2和MMP-9蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋（Hh）、β-折疊（Tt）、無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）和延伸鏈（Ee），其中MMP-2和MMP-9無(wú)規(guī)則卷曲含量均最高。在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)，MMP-2與1gxd.2.A結(jié)構(gòu)具有87.79%相似性，MMP-9與1l6j.1.A結(jié)構(gòu)相似性為84.34%。兩種蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致（見(jiàn)圖4）。

圖4 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction resultsof advanced structure of yak MMP-2 and MMP-9 proteins

利用Psipred-FFPred 3預(yù)測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白質(zhì)功能。結(jié)果顯示，兩種蛋白通過(guò)與金屬離子Ca2+和Zn2+結(jié)合實(shí)現(xiàn)主要功能，且與Zn2+結(jié)合更緊密；無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的MMP-2其內(nèi)肽酶活性和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)比有信號(hào)肽的MMP-9更活躍，而MMP-9主要在細(xì)胞外區(qū)域發(fā)揮作用。STRING分析發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖5），MMP-2與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2（Metalloproteinase inhibitor 2，TIMP-2）蛋白相關(guān)性高達(dá)0.999，與MMP-14和Ⅰ型膠原蛋白（Collagenα-1，COL1A1）相關(guān)性分別高達(dá)0.955和0.991；MMP-9與TIMP-1和TIMP-2相關(guān)性分別高達(dá)0.995和0.992，且與膠原類(lèi)MMPs（MMP-1、MMP-8）相關(guān)性均高達(dá)0.968。

圖5 MMP-2和MMP-9蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.5 MMP-2 and MMP-9 protein network interaction analysis

2.6 牦牛MMP-2和MMP-9基因組織表達(dá)水平

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP-2、MMP-9、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1基因在0.5、1.5和2.5歲麥洼牦牛臀大肌和心臟中mRNA表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖6，MMP-2和MMP-9在不同年齡牦牛臀大肌組織中表達(dá)水平均隨年齡增長(zhǎng)而上升，MMP-2在0.5～2.5歲、1.5～2.5歲呈顯著差異（P＜0.05），MMP-9在0.5～1.5歲、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。MMP-14和CL3A1隨其年齡增長(zhǎng)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），然而CL1A1表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而下降，其中在0.5～1.5歲、1.5～2.5歲存在顯著差異（P＜0.05）。此外，TIMP-1和TIMP-2在牦牛不同年齡臀大肌組織中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，差異不顯著。

圖6 牦牛MMP-2、MMP-9、MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1基因組織表達(dá)分析Fig.6 mRNA expression of yak MMP-2,MMP-9,MMP-14,TIMP-1,TIMP-2,CL1A1 and CL3A1 genes in different tissues

MMP-2和MMP-9在不同年齡牦牛心臟組織中mRNA表達(dá)隨年齡增長(zhǎng)而增加。其中MMP-2在0.5～1.5歲呈顯著差異（P＜0.05），0.5～2.5歲、1.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。MMP-9在0.5～1.5歲、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。然而，MMP-14、TIMP-1、TIMP-2、CL1A1和CL3A1在0.5、1.5、2.5歲牦牛心臟組織中表達(dá)量差異均不顯著。

MMP-2在同一年齡臀大肌mRNA表達(dá)水平均高于心臟組織，分別在0.5歲和2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01），1.5歲呈顯著差異（P＜0.05）。MMP-9在臀大肌和心臟中的mRNA表達(dá)差異不顯著。

2.7 牦牛MMP-2和MMP-9蛋白在臀大肌中表達(dá)

采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白在不同年齡牦牛臀大肌組織中表達(dá)情況（見(jiàn)圖7），發(fā)現(xiàn)二者均呈隨年齡增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)，其中MMP-2在0.5～1.5、0.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01），MMP-9在0.5～2.5、1.5～2.5歲呈極顯著差異（P＜0.01）。

圖7 不同年齡牦牛臀大肌中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)分布Fig.7 Expression of MMP-2 and MMP-9 in gluteus maximus at different ages

3 討論

MMP-2和MMP-9基因已被證明可在牛[6-7]、豬[12]、雞[13]等畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)牦牛MMP-2和MMP-9編碼氨基酸中甘氨酸含量均最高，其次分別為天冬氨酸和亮氨酸。甘氨酸是保證肉質(zhì)風(fēng)味所必需前體氨基酸，含較多甘氨酸的肉質(zhì)味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富[14]。亮氨酸作為支鏈氨基酸一種，有助于促進(jìn)人體訓(xùn)練后肌肉損傷修復(fù)，可通過(guò)下調(diào)雄性激素或減少肌蛋白分解的方式減輕肌肉勞損并防止骨骼肌損傷[15]。本研究結(jié)果表明，明膠類(lèi)酶MMPs對(duì)牦牛肉質(zhì)有影響。心臟收縮所需能量來(lái)源之一是通過(guò)TCA循環(huán)氧化脂肪酸天冬氨酸合成過(guò)程，從而生成大量ATP。作為賴(lài)氨酸等其他氨基酸合成前體之一的天冬氨酸，其合成可緩解因壓力超負(fù)荷引起的心臟肥大，起改善心肌收縮功能、保護(hù)心肌作用[16]，所以明膠類(lèi)酶MMPs蛋白中天冬氨酸對(duì)心臟功能也有影響。MMPs主要通過(guò)對(duì)組織ECM中膠原蛋白降解調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)明膠類(lèi)酶MMPs作為FN2結(jié)構(gòu)域（可識(shí)別、捕獲明膠）超家族分支之一，利用該結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)肌肉調(diào)控等相關(guān)功能。MMP-2激活時(shí)形成pro-MMP-2/MMP-14/TIMP-2三聯(lián)體，可促進(jìn)明膠酶捕獲ECM膠原，增強(qiáng)水解膠原能力[17]。這與本研究對(duì)牦牛明膠類(lèi)酶MMPs蛋白互作預(yù)測(cè)分析結(jié)果相符。MMP-9與膠原類(lèi)MMPs相關(guān)性均高達(dá)0.968，表明MMP-9對(duì)各類(lèi)膠原蛋白有較強(qiáng)降解效果，而蛋白功能互作預(yù)測(cè)也為明膠類(lèi)酶MMPs在肌肉組織ECM中對(duì)關(guān)鍵底物膠原蛋白水解提供理論依據(jù)。此外，MMP-2和MMP-9蛋白均含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)，MMPs磷酸化與糖基化對(duì)酶活性調(diào)控有重要作用。Sariahmetoglu等使用堿性磷酸酶對(duì)MMP-2蛋白酶中Thr250、Tyr271、Ser32、Ser160和Ser365磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)MMP-2酶活性由此提升，但MMP-9與MMP-2磷酸化產(chǎn)生效果存在差異[18]。Nam等研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)胃上皮細(xì)胞被幽門(mén)螺旋桿菌感染后，細(xì)菌釋放CagA毒力因子可激活細(xì)胞ERK磷酸化信號(hào)通路中的SHP-2酪氨酸磷酸酶，侵染后細(xì)胞MMP-9活性因酪氨酸磷酸化而增強(qiáng)[19]。Ru等發(fā)現(xiàn)CD147（心肌細(xì)胞上廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白）糖基化，可誘導(dǎo)心臟中MMP-2和MMP-9分泌和活化，促進(jìn)MMPs降解I型和III型膠原蛋白，緩解因膠原交聯(lián)引起心肌肥大[20]。明膠類(lèi)酶MMPs均為分泌蛋白[21]，而本研究結(jié)果顯示MMP-2無(wú)N-糖基化位點(diǎn)、無(wú)信號(hào)肽，MMP-2催化域的前肽區(qū)存在一個(gè)半胱氨酸開(kāi)關(guān)基序[22]，可通過(guò)磷酸化通路如ERK1/2進(jìn)行激活和分泌[10]，且pro-MMP-2可在細(xì)胞膜上與MMP-14和TIMP-2結(jié)合，形成pro-MMP-2/MMP-14/TIMP-2三聯(lián)體，故經(jīng)分析認(rèn)為MMP-2通過(guò)此方式分泌細(xì)胞[17]。根據(jù)信號(hào)肽假說(shuō)，牦牛MMP-2可能是一類(lèi)非典型分泌蛋白[23]，具體研究有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

牦牛MMP-2和MMP-9蛋白在細(xì)胞內(nèi)、外均有分布。Yeghiazaryan等利用明膠酶譜法檢測(cè)經(jīng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后小鼠比目魚(yú)肌中活性MMP-2和MMP-9分布情況[24]，發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞核內(nèi)MMP-2酶原和激活態(tài)以及細(xì)胞質(zhì)中MMP-9激活態(tài)分布明顯上升，說(shuō)明明膠類(lèi)酶MMPs可參與肌肉對(duì)訓(xùn)練的適應(yīng)性反應(yīng)，且在肌核功能調(diào)控作用中，MMP-2比MMP-9更顯著。該研究還發(fā)現(xiàn)訓(xùn)練后小鼠比目魚(yú)肌細(xì)胞ECM中充滿(mǎn)激活的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞或成肌細(xì)胞，表明高表達(dá)的MMP-9可激活肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，參與骨骼肌修復(fù)。在小鼠心肌組織的平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中均檢測(cè)出MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，且無(wú)論是在胞內(nèi)亞細(xì)胞器（胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞核）或是胞外蛋白（如肌節(jié)），均能檢測(cè)到MMP-2和MMP-9蛋白酶以及與心肌發(fā)育調(diào)控相關(guān)的作用底物如鈣調(diào)節(jié)蛋白-1、心肌素、α-輔肌動(dòng)蛋白和MHC[25]共表達(dá)。本研究對(duì)牦牛MMP-2和MMP-9細(xì)胞亞細(xì)胞器定位預(yù)測(cè)結(jié)果與前人研究結(jié)果相符，故也可為牦牛明膠類(lèi)酶MMPs在細(xì)胞層面功能驗(yàn)證研究提供數(shù)據(jù)參考。

MMP-2和MMP-9基因在牦牛肌肉組織中mRNA表達(dá)隨年齡增加而顯著上升。麥洼牦牛主要分布在海拔3 700 m高原環(huán)境，而活性氧（ROS）隨血液攜氧量增加而增加[26]，牦牛較南陽(yáng)牛ROS含量低，牦牛和南陽(yáng)牛MMP-2和MMP-9表達(dá)水平存在差異[27]，這可能是本研究MMP-2基因表達(dá)與祁艷霞等[6]在不同年齡南陽(yáng)牛肌肉組織中MMP-2表達(dá)結(jié)果相反的原因。牦牛性成熟年齡為3.5～4.5周歲，0.5～2.5歲牦牛屬于幼年期，肌肉生長(zhǎng)發(fā)育速度較快，各類(lèi)細(xì)胞干性處于最佳時(shí)期。MMP-2和MMP-9在牦牛肌肉組織中的表達(dá)與年齡增長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)，作為明膠類(lèi)酶MMPs底物的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，也是影響肉品質(zhì)重要蛋白質(zhì)[28]，同時(shí)Ⅰ型膠原蛋白是骨骼肌中含量最高膠原[29]。兩種蛋白是MMP-2和MMP-14的主要降解對(duì)象[30]，所以幼年期牦牛臀大肌組織中CL1A1基因表達(dá)在0.5～2.5歲呈現(xiàn)顯著性下降可能與MMP-2和MMP-14表達(dá)顯著升高有關(guān)。此外，TIMP-1和TIMP-2在不同年齡麥洼牦牛肌肉組織中表達(dá)水平無(wú)顯著差異，表明MMP-2和MMP-9在基因表達(dá)水平上可能存在對(duì)CL1A1有抑制作用。此外，臀大肌免疫組織化學(xué)結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果趨勢(shì)相似，表明明膠類(lèi)酶MMPs的基因表達(dá)與組織分布有緊密關(guān)聯(lián)，后續(xù)可增加對(duì)該酶蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證試驗(yàn)。

隨MMPs家族在肌肉組織及細(xì)胞中研究日益增多，已有報(bào)道證明明膠類(lèi)酶MMPs對(duì)骨骼肌組織及肌細(xì)胞修復(fù)、增殖和分化等生物過(guò)程有直接影響，故MMPs對(duì)骨骼肌組織的調(diào)控作用尤為重要。目前未見(jiàn)牦牛不同生長(zhǎng)階段明膠類(lèi)酶MMPs基因表達(dá)水平的報(bào)道，本研究得到的MMP-2和MMP-9在不同年齡骨骼肌組織中mRNA和蛋白表達(dá)存在顯著差異，說(shuō)明牦牛明膠類(lèi)酶MMPs表達(dá)具有組織差異特點(diǎn)，也表明明膠類(lèi)酶MMPs可作為潛在的牦牛骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育靶點(diǎn)或者牦牛選育的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

本研究首次測(cè)序獲得牦牛MMP-2和MMP-9基因序列，且發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9在牦牛臀大肌和心臟中mRNA表達(dá)與年齡呈顯著正相關(guān)，二者在臀大肌組織中基因和蛋白表達(dá)分布趨勢(shì)相似。研究結(jié)果為進(jìn)一步探索牦牛明膠類(lèi)酶MMPs在牦牛肉品質(zhì)與肌肉生長(zhǎng)方面調(diào)控作用提供參考。