野生大豆GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水脅迫下功能分析

丁曉東，張 晴，于海燕，劉圓明，李明龍，肖佳雷

（1.東北農業大學農業生物功能基因重點實驗室，哈爾濱 150030；2.望奎縣種子能源服務中心，黑龍江 望奎 152100）

大豆（Glycinemax）蛋白含量和出油率高，種植面積廣泛，是我國重要糧食作物之一[1-2]。其中栽培大豆對淹水脅迫較為敏感，當發生澇害時，其根系淹水漚根，葉片黃化，大豆光合速率、株高、莢果數和種子產量降低[3-4]。野生大豆是栽培大豆親緣種，在形態上具有發達根系和柔性藤蔓狀枝干，在基因水平上具有遺傳多樣性，對環境適應性強，對澇害具有較強耐受性[5]。研究野生大豆淹水脅迫分子調控機制，可為大豆抗澇品種育種提供理論基礎。同時，來自野生大豆的優良基因可直接應用于栽培大豆育種，解決栽培大豆對淹水脅迫較為敏感的問題，對實現栽培大豆品種改良具有重要意義。

植物蔗糖非發酵-1-相關蛋白激酶-1在參與生長發育、基礎代謝、脅迫應答以及碳氨代謝等多項生理活動中發揮重要作用[6-8]。Lovas等最早發現植物SnRK1蛋白激酶在馬鈴薯高鹽脅迫下敏感性，發現馬鈴薯反義StubGAL83基因在高鹽脅迫下根細胞較小比野生型更為敏感；SnRK1蛋白激酶可通過改變淀粉合成，將其回流到植物根中，從而影響地上部分植物口感，減少食草性動物食用[9]。番茄葉片中SISNF基因在干旱脅迫下表達量升高，猜想番茄SISNF基因參與干旱脅迫調控[10]。Kudahettige等發現在淹水處理下，擬南芥中過量表達水稻SnRK1基因，促進植物體內淀粉降解，提升對植物細胞能量供給和植物存活能力[11]。但SnRK1如何響應淹水脅迫，增強植物抗逆性的分子機制尚不明確。

由于栽培大豆是重要糧食作物，其野生近緣種野生大豆對環境適應環境能力強，喜水耐濕，多生于山野以及河流沿岸、濕草地、湖邊、沼澤等地，因此野生大豆是研究耐淹水基因重要植物材料。為研究GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水脅迫中作用與功能，在野生大豆（Glycinesoja）中克隆GsSnRK1.1基因、啟動子及點突變基因；在Col-0野生型擬南芥中超表達以35S啟動子驅動的GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，獲得轉基因植株；通過對野生大豆不同時間淹水處理，利用RT-qPCR分析GsSnRK1.1基因在淹水脅迫條件下時空表達模式，同時也對pGsSnRK1.1::GUS轉基因擬南芥植株作GUS染色，從側面印證qRT-PCR數據正確性；將GsSnRK1.1基因在擬南芥中過量表達，測定其葉綠素、SOD和Pro等生理指標，以及ADH1（EC1.1.1.1）、PDC1（EC4.1.1.1）標記淹水應激反應基因在Col-0與轉基因擬南芥中基因表達。試驗對GsSnRK1.1基因功能驗證分析，為探究大豆抗澇品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

野生大豆為Glycine soja（G07256），擬南芥為Columbia-0，以pCAMBIA3301和pCAMBIA2300為植物表達載體。研究所用菌株為農桿菌GV3101和大腸桿菌DH5α。以上材料均由東北農業大學植物與環境互作實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA、總DNA提取及cDNA合成

將飽滿且無病蟲害野生大豆（G07256）種子用濃硫酸處理6～10 min去除種皮表面泥膜，倒掉濃硫酸，自來水沖洗5次。沖洗后種子放在含濕潤濾紙培養皿上，為其提供萌發所需水分，25℃黑暗培養，培養時間為2～3 d。當種子發芽達到2 cm時，轉移至人工氣候室水培，設置溫度為25℃，營養液每隔2～3 d更換一次。待幼苗生長至六葉期時，使用相應試劑盒提取總RNA/DNA以及反轉錄合成cDNA。

1.2.2 基因克隆

根據NCBI基因數據庫所提供GsSnRK1.1（KHN13196）基因及其啟動子CDS全長序列信息，使用Primer Premier 5.0設計引物。克隆所用模板為野生大豆cDNA和DNA，作基因及啟動子序列擴增。進一步根據位點設計引物，引物序列如表1所示。通過引物重疊PCR方法獲得激酶調控區域失活的轉錄本GsSnRK1.1（T176A）、激酶調控區域模擬磷酸化的轉錄本GsSnRK1.1（T176E）和催化區域失活的轉錄本GsSnRK1.1（K49M）基因片段。其中將GsSnRK1.1第176位蘇氨酸（Thr，T）密碼子替換為谷氨酸（Glu，E）與丙氨酸（Ala，A）密碼子，第49位賴氨酸（Lys，K）密碼子突變為甲硫氨酸（Met，M）密碼子。KpnⅠ-XbaⅠ內切酶酶切pCAMBIA2300質粒使之線性化，再利用T4DNA連接酶構建超表達載體，獲得p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176A）、p2300-35S-Myc-GsSnRK1.1（T176E）、p2300-35SMyc-GsSnRK1.1（K45M）超表達載體；Eco RⅠ-NcoⅠ內切酶酶切pCAMBIA3301質粒使之線性化，利用T4DNA連接酶將GsSnRK1.1基因內源啟動子替換載體原本35S啟動子獲得p3301-GsSnRK1.1P-GUS啟動子報告表達載體；BglⅡ-BstEⅡ內切酶酶切p3301-GsSnRK1.1P-GUS，再利用同源重組試劑盒構建載體，獲得p3301-GsSnRK1.1P-Myc-GsSnRK1.1

1.2.3 轉基因植株獲得

利用凍融法將構建成功的過表達載體和啟動子驅動GUS基因重組質粒轉入農桿菌，而后農桿菌侵染模式植物擬南芥，使用方法為蘸花法[12]。種植完成侵染的擬南芥種子，長出兩片子葉時開始噴灑抗生素篩選轉基因植株，其中利用卡納霉素和除草劑（Basta）分別噴灑pCAMBIA2300和pCAMBIA3301載體侵染的擬南芥。篩選過后對其作PCR和Western blot鑒定，確定是否為轉基因純合體株系。

1.2.4 表型分析及生理指標測定

為模擬長時間淹水情況，將擬南芥野生型和缺失突變體種子置于滅菌EP管中，加入1 mL 30%NaClO，消毒15 min，用滅菌ddH2O清洗種子6～8次，最后向EP管中加入適量滅菌ddH2O，4℃春化處理48 h。用滅菌牙簽將種子點在含0.8%瓊脂和1%蔗糖的1/2MS固體培養基試管中，將試管置于人工氣候箱中培養。待植物生長至四葉期時，將10 mL經高壓滅菌過蒸餾水小心灌入每個試管中，黑暗中放置37 d，觀察其表型并測定生理指標。

1.2.5 淹水應激反應標記基因表達分析

對淹水脅迫處理37 d擬南芥幼苗提取總RNA，利用RT-qPCR測量乙醇脫氫酶1（ADH1；At1g77120）和丙酮酸脫羧酶1（PDC1；At4g33070）標記基因對淹水脅迫的響應。

1.2.6 野生大豆GsSnRK1.1表達特性分析

將三周齡野生大豆幼苗完全浸沒至水中處理2 d，分別在0、6、12、24及48 h不同時間點取樣；選用Plant RNA Kit（OMEGA）提取總RNA，使用ReverTra Ace qPCRRTMaster MIX with gDNA Remover cDNA試劑盒（TOYOBO）反轉錄合成cDNA，使用SYBRGreen試劑盒（TOYOBO）對GsSnRK1.1基因作實時熒光定量PCR，結果分析采用比較CT法（ΔΔCT法）。

2 結果與分析

2.1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆與序列分析

PCR擴增結果見圖1，獲得GsSnRK1.1基因、啟動子及點突變基因，其中基因長度為1 548 bp，啟動子長度為1 663 bp，因此選擇DL2000 DNA Marker。經克隆、測序確定GsSnRK1.1為所需研究基因。

圖1 野生大豆GsSnRK1.1基因克隆及點突變測序Fig.1 GsSnRK1.1 gene cloning and point mutation sequencing

2.2 野生大豆GsSnRK1.1基因表達響應淹水脅迫

SnRK1是一種廣泛存在于植物體內的Ser/Thr蛋白激酶，其蛋白活性對植物體生長發育、新陳代謝及非生物脅迫抗逆具有重要作用。為探究野生大豆GsSnRK1.1基因對淹水脅迫的響應，分別對野生大豆淹水處理0、6、12、24和48 h，并對不同淹水時間處理野生大豆內源GsSnRK1.1基因作轉錄水平分析。結果如圖2所示，隨淹水處理時間增加，野生大豆中GsSnRK1.1基因轉錄水平隨之顯著升高。為進一步探究野生大豆GsSnRK1.1基因啟動子對淹水脅迫的響應，構建pGsSnRK1.1::GUS穩定表達株系，GUS染色結果如圖3所示，可觀察到與未淹水處理對照組相比，淹水處理后染色效果更為明顯，說明GsSnRK1.1基因啟動子感知淹水脅迫進而促進基因轉錄。

圖2 GsSnRK1.1在淹水脅迫下表達模式Fig.2 Expression pattern of GsSnRK1.1 gene under waterlogging stress

圖3 淹水脅迫下proGsSnRK1.1:GUS轉基因幼苗GUS染色Fig.3 GUSstaining of proGsSnRK1.1::GUS transgenic seedlings under waterlogging stress

2.3 GsSnRK1.1及其點突變在擬南芥中超表達鑒定

為研究GsSnRK1.1蛋白激酶在植物抵抗淹水脅迫中功能，將GsSnRK1.1及其3個活性位點突變基因在Col-0擬南芥中超表達。以atkin10為陰性對照，利用相應抗性篩選后獲得T1代，再利用T5 Direct PCR（plant）試劑盒對初步篩選得到的轉基因植株作基因型鑒定，如圖4所示，Col-0超表達植株對GsSnRK1.1及其3個位點突變基因作PCR鑒定，基因長度為1 548 bp。

圖4 GsSnRK1.1及其3個點突變基因超表達植株PCR鑒定Fig.4 PCR identification of overexpressed plantswith GsSnRK1.1 and three point mutated genes

從鑒定正確的T1代單個植株上收集種子，進一步對T2代作抗性和基因型篩選，獲得純合T3植株。為進一步確認轉基因超表達和回補T3代擬南芥中蛋白表達，提取擬南芥葉片蛋白，并作Western blot蛋白水平測定，結果如圖5所示，通過anti-Myc抗體驗證確定35S啟動子驅動的Myc-GsSnRK1.1、Myc-GsSnRK1.1（T176E）、Myc-GsSnRK1.1（T176A）、Myc-GsSnRK1.1（K49M）和空載體轉化的純合T3代中靶蛋白表達水平。

圖5 轉基因擬南芥Western blot蛋白水平檢測Fig.5 Western blot protein level detection of transgenic Arabidopsis thaliana

2.4 GsSnRK1.1在淹水脅迫下生理指標測定

為進一步確定GsSnRK1.1蛋白激酶在淹水脅迫中生理功能，本研究利用超表達GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）研究擬南芥轉基因植株。如圖6所示，Col-0綠化程度略高于atkin10，但并不明顯；表達GsSnRK1.1蛋白激酶和模擬磷酸化GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176E）的擬南芥葉片明顯呈綠色，且比Col-0綠化程度更高；而表達催化區域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#K49M）和表達調控區域失活的GsSnRK1.1蛋白激酶（OE#T176A）的擬南芥在淹水條件下明顯葉片失綠，且比atkin10綠化程度更低；進一步測定各株系葉綠素含量，如圖7所示，葉綠素含量與表型相符，說明GsSnRK1.1蛋白激酶活性可降低擬南芥在淹水條件下葉片失綠。

圖6 淹水脅迫下轉基因株系表型Fig.6 Phenotypesof transgenic linesunder waterlogging stress

圖7 淹水脅迫下轉基因擬南芥葉綠素含量Fig.7 Chlorophyll content of transgenic Arabidopsis thaliana under waterlogging stress

測定經淹水脅迫處理后轉基因擬南芥體內超氧化物歧化酶（SOD）和脯氨酸（Pro）含量，并計算淹水處理前后SOD和Pro含量增加倍數。如圖8A所示，經淹水脅迫后，Col-0體內SOD酶活增加約20倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E體內SOD酶活增加倍數約為35倍，且顯著高于Col-0；OE#T176A體內SOD酶活增加約10倍，OE#K49M體內SOD酶活增加約7倍，atkin10體內SOD酶活增加約6倍，均顯著低于Col-0。如圖8B所示，淹水處理后，Col-0體內Pro含量增加約50倍，OE#GsSnRK1.1和OE#T176E體內Pro含量增加倍數分別約為140倍和170倍，且顯著高于Col-0株系；OE#T176A體內Pro含量增加約23倍，OE#K49M體內Pro含量增加約24倍，atkin10株系中Pro含量增加約20倍，且三者均顯著低于Col-0株系。由此說明，GsSnRK1.1可提高擬南芥SOD活性和Pro含量以抵抗淹水脅迫。

圖8 淹水脅迫下轉基因株系中SOD和Pro含量增加倍數Fig.8 Fold increase of SOD and Pro contents of transgenic lines under waterlogging stress

2.5 GsSnRK1.1影響淹水應激反應標記基因表達

乙醇脫氫酶1（ADH1）和丙酮酸脫羧酶1（PDC1）是標記淹水應激反應基因，為檢測SnRK1活性對氧缺乏期間基因調節的影響，測定ADH1和PDC1標記基因在淹水脅迫下表達。如圖9所示，ADH1和PDC1在Col中上調，并在表達OE#GsSnRK1.1（野生型GsSnRK1.1）和OE#GsSnRK（T176E）（表達模擬磷酸化GsSnRK1.1）轉基因植物中進一步上調，但在OE#GsSnRK1.1（T176A）和OE#GsSnRK1.1（K49M）（表達無激酶活性的GsSnRK1.1）轉基因植物中幾乎未發生ADH1和PDC1基因上調。結果表明，GsSnRK1.1誘導淹水應激反應的兩個標記基因表達，其依賴于GsSnRK1.1蛋白激酶活性。

圖9 淹水應激反應標記基因表達模式Fig.9 Expression pattern of marker genes for stress responseto flooding

3 討論

植物中蔗糖非發酵-1-相關蛋白激酶-1（SnRK1）與酵母SNF1和哺乳動物（AMPK）同源[11]。其中SnRK1蛋白激酶在感應新陳代謝方面具有重要意義，可抵抗各種壓力并保持能量穩態[12]。SnRK1在植物抵抗生物及非生物脅迫過程中發揮作用，添加葡萄糖和ABA處理時，超表達SnRK1植株對ABA敏感程度更強。PP2C被ABA降低進一步提高SnRK1活性，通過兩個互補過程相互作用增強應激反應，并為ABA和糖信號通路之間廣泛遺傳相互作用提供解釋[14-15]。SnRK1α植物防御機制在食草動物、真菌、細菌和病毒中扮演重要角色[16-17]。首次發現植物SnRK1參與脅迫響應是反義表達StubGAL83的馬鈴薯對高鹽脅迫極其敏感[18]。AtKIN10（SnRK1.1）在擬南芥耐淹性和抗鹽信號途徑調節過程中存在拮抗作用[19]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）SnRK1活性提升擬南芥耐淹水能力，參加控制脅迫耐受的信號途徑存在特異性，超表達失去激酶活性的OsSnRK1或者AtKIN10突變轉錄本植株，在淹水處理下其葉片明顯白化[20]。本研究發現GsSnRK1.1可提高轉基因擬南芥對淹水脅迫抗性，且在抵抗淹水脅迫中GsSnRK1.1蛋白激酶酶活性發揮關鍵作用。

植物受淹水脅迫后降低光合速率，進而影響其生長發育及產量收益，因此挖掘和利用抗逆基因資源對提高作物抗逆性非常重要。本研究選用野生大豆為植物材料，從中克隆GsSnRK1.1基因，通過多序列比對發現其蛋白結構中保守的STKc-AMPK-alpha結構域，以及對于行使蛋白激酶功能十分重要的保守氨基酸位點：K49和T176。其中第176位蘇氨酸（Thr，T）是受上游激酶調控的特異性磷酸化位點，當其被上游激酶磷酸化，則激活催化區域第49位賴氨酸（Lys，K）從而磷酸化下游底物蛋白，影響植物生長發育。在Col-0野生型擬南芥中超表達以35S啟動子驅動GsSnRK1.1、GsSnRK1.1（T176A）、GsSnRK1.1（T176E）和GsSnRK1.1（K49M）基因，獲得轉基因植株，檢測GsSnRK1.1蛋白激酶活性對淹水脅迫標記基因調節的影響，并測定ADH1和PDC1標記基因在淹水脅迫下基因表達，結果表明，野生大豆GsSnRK1.1誘導淹水應激反應的兩個標記基因表達，GsSnRK1.1基因對淹水脅迫響應，且參與淹水應激反應調控。有關GsSnRK1.1蛋白激酶對淹水脅迫下大豆根系乙醇脫氫酶、活性氧代謝系統及碳氮代謝等影響仍需進一步研究。